Prkdc基因及其在NHEJ中的作用

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基因基本信息

備注：標(biāo)有√的意為賽業(yè)紅鼠資源庫有該種保存狀態(tài)的小鼠

Prkdc編碼的DNA-PKcs

DNA依賴性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase, DNA-PK）是一個由DNA激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，大量表達(dá)在幾乎所有哺乳動物的細(xì)胞中。DNA-PK是DNA修復(fù)的關(guān)鍵蛋白激酶，參與了非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)。此外，DNA-PK也參與了基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程[1]。DNA-PK由3個亞基組成：Ku80、Ku70和DNK-PKcs（圖1）。其中，XRCC5基因編碼了Ku80，XRCC6基因編碼了Ku70，而Prkdc基因編碼了DNK-PK的催化亞基（DNA-PKcs）。DNA-PKcs 能被分為三個大型結(jié)構(gòu)單位：一個N端螺旋結(jié)構(gòu)域（N-terminal arm），一個含有多種HEAT（Huntingtin, Elongation Factor 3, PP2A和TOR1）重復(fù)序列和大量保守的磷酸化簇的圓形搖籃結(jié)構(gòu)域（circular cradle），以及一個含有高度保守的激酶結(jié)構(gòu)域（kinase）的C端結(jié)構(gòu)域（C-terminal head）。

圖1. DNA-PK的結(jié)構(gòu)[2]

A）Ku80顯示為黃色，Ku70顯示為綠色，DNA-PKcs顯示為彩色。Ku70和Ku80的核心（core）形成與DNA結(jié)合的Ku異二聚體，如圖B所示。Ku80CTR和Ku70CTR代表了兩個蛋白的C端區(qū)域（C-terminal regions，CTR）。與DNA-PKcs互相作用的C端區(qū)域顯示為黑色。

B）上圖：與DNA結(jié)合的Ku70/80的晶體結(jié)構(gòu)(PDB code: 1JEY) 。下圖：Ku80CTR球狀結(jié)構(gòu)域（globular domain）的核磁共振結(jié)構(gòu)(PDB code: 1Q2Z) 。

C) DNA-PKcs的晶體結(jié)構(gòu)(PDB code: 5LUQ)，著色方案與圖A對應(yīng)。Head包括FAT (FRAP, ATM, TRRAP), FRB(FKBP12-rapamycin-binding), kinase和FATC (FAT C-terminal) 結(jié)構(gòu)域。Ku80CTR的三個螺旋結(jié)構(gòu)顯示為黑色。

DNA-PKcs 參與了NHEJ

DNA的雙鏈斷裂（double-strand breaks，DSBs）是最嚴(yán)重的一種DNA損傷，可由多種內(nèi)源性因素（例如V（D）J重排），或外源性因素引起（例如電離輻射）。如果不能被修復(fù)，DSBs可能會引起同源染色體斷裂和細(xì)胞死亡[3]。DSBs主要通過兩種方式進行修復(fù)：同源重組(homologous recombination，HR）和非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)。細(xì)胞周期是影響DSBs修復(fù)機制的主要因素：HR修復(fù)需要DNA復(fù)制時姐妹染色單體上的同源序列的存在，以此為模板指導(dǎo)修復(fù)的精確進行。因此，HR修復(fù)是精確的（error-free），主要發(fā)生在細(xì)胞周期（cell cycle）中的S期。而NHEJ修復(fù)不需要借助同源模板鏈的幫助，NHEJ機制中的修復(fù)蛋白直接將雙鏈斷裂的末端拉近距離，再由DNA連接酶（ligase）將斷裂處連接。因此，NHEJ是快速但不精準(zhǔn)的（error-prone），在整個細(xì)胞周期中都能起作用（主要是是G1和G2期）。

在NHEJ中，Ku70與Ku80能在斷裂的DNA末端迅速組裝成Ku異二聚體，招募并激活DNA-PKcs，而Artemis核酸酶被DNA-PKcs磷酸化后，能打開DNA發(fā)夾中間體，然后由XLF，Ligase IV和XRCC4d 復(fù)合物催化再連接（圖2A）。特別地，NHEJ機制也存在于T、B 細(xì)胞的 T 細(xì)胞抗原受體（TCR）、B 細(xì)胞抗原受體（BCR）基因的V（D）J重排中。在這里，DSBs是由重組酶Rag1和Rag2識別并剪切V（D）J片段相鄰的重組信號序列（recombination signal sequence，RSS）造成的。其中，Rag1和Rag2、Ku70和80、XRCC4和Ligase IV是信號序列連接（signal join）和編碼序列連接（coding join）所必需的；而DNA-PKcs 和Artemis則是編碼序列連接所必需的（圖2B）。此外，缺乏不同V（D）J重組所需蛋白質(zhì)的小鼠也展示出不同表型（表1）。

圖2. NHEJ通路[4]

(A) 輻照等造成的DNA雙鏈斷裂（DSBs）。括號表示不同細(xì)胞類型可能表現(xiàn)出不同程度的對Artemis和DNA-PKcs的依賴性。

(B) V（D）J重排造成的DNA雙鏈斷裂（DSBs）。PSC：剪切后突觸復(fù)合體（postcleavage synaptic complex）。

表1. 缺乏V（D）J重組所需蛋白質(zhì)的各種小鼠表型[4]

DNA-PKcs 與腫瘤

DNA-PKcs是NHEJ途徑的關(guān)鍵組成部分，也是一種潛在的癌癥治療靶標(biāo)。我們可以通過抑制DNA-PKcs活性，使腫瘤細(xì)胞對電離輻射（IR）和DSB誘導(dǎo)劑敏感，從而提高放療和化療效果。目前，已有多種小分子DNA-PKcs抑制劑。例如，Willoughby等人發(fā)現(xiàn)NU5455，小分子DNA-PKcs抑制劑，能有效增強對肺癌定向放療和對肝細(xì)胞癌局部化療的治療指數(shù)（therapeutic index）[5]。

圖3. 小分子DNA-PKcs抑制劑NU5455[5]

小結(jié)

Prkdc基因編碼了DNA蛋白激酶的催化亞基（DNA-PKcs），DNA-PKcs作為NHEJ途徑中的關(guān)鍵組成部分，在維持基因組完整性上起到了重要作用。帶有PrkdcSCID突變的SCID小鼠由于DNA-PKcs缺陷，V（D）J重排受阻，因此缺乏功能性T、B細(xì)胞。但同時，隨著年齡增長，SCID小鼠也可能產(chǎn)生免疫泄露（leakiness），即小鼠體內(nèi)產(chǎn)生少量的有功能的T、B細(xì)胞和免疫球蛋白。目前，這種免疫泄露的分子機制仍不明確，且不同遺傳背景的SCID小鼠中的免疫泄露發(fā)生率不同：一般來說，SCID小鼠在C57BL/6J 和BALB/c 背景上的泄漏率高；在C3H背景上較低；而在NOD背景上極低。

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NOD scid

表型信息及應(yīng)用：

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☑ 移植致死性胸腺淋巴瘤的情況下壽命短。

NOD scid表型驗證：CDX模型

人肺癌細(xì)胞（A549）在NOD scid小鼠上能更有效地建立腫瘤模型

分別將5×106 A549細(xì)胞以皮下注射的形式接種到BALB/c nude和NOD scid小鼠體內(nèi)，并在不同的時間點測量成瘤體積和小鼠體重。數(shù)據(jù)以Mean±SEM形式呈現(xiàn)。

研究應(yīng)用：

☑ 同種移植和異種移植，可用于評估腫瘤細(xì)胞增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移的潛力，以及抗癌療法的功效。

☑ 腫瘤免疫學(xué)及炎癥研究。

☑ 糖尿病和肥胖研究：I型糖尿病。

☑ 血液學(xué)研究（例如白血�。�。

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參考文獻(xiàn)：

[1] 江娜, 沈瑛, 孔憲明, & 糜軍. (2011). DNA-PK蛋白功能及其調(diào)控機制. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志, 08(003), 278-282.

[2] Wu Q, Liang S, Ochi T, et al. (2019). Understanding the structure and role of DNA-PK in NHEJ: How X-ray diffraction and cryo-EM contribute in complementary ways. Prog Biophys Mol Biol, 147:26-32.

[3] 胡榮杭, & 溫劍虎. (2006). Dna依賴的蛋白激酶研究新進展. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 31(0z1), 23-26.

[4] Bassing C.H., Swat W., Alt F.W. (2002). The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109 Suppl:S45-55.

[5] Willoughby, C.E., Jiang, Y., Thomas, H.D., et al. (2020). Selective DNA-PKcs inhibition extends the therapeutic index of localized radiotherapy and chemotherapy. The Journal of clinical investigation, 130(1), 258–271.