文獻解讀：焦亡效應分子GSDMD負反饋調控炎癥小體激活新機制

炎癥是機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一種保護效應，在對抗機體感染，清除體內異物，以及對局部組織損傷進行修復等過程中發(fā)揮著重要作用。然而過度活化的炎癥反應會對機體造成損傷，引起膿毒癥、糖尿病、心血管疾病、炎癥性腸病和神經(jīng)退行性疾病等一系列炎癥性疾病發(fā)生^[1-5]。在不斷進化過程中，機體免疫系統(tǒng)已產(chǎn)生許多負反饋調控機制對炎癥進行精準調控，如IkB抑制NF-κB炎癥通路^[6]，A20抑制TRAF6信號通路^[7]，SOCS3抑制JAK2/STAT3炎癥通路^[8]等，這些研究都強調了負反饋調節(jié)在控制炎癥中的重要作用。

炎癥小體是機體重要的固有免疫炎癥蛋白質機器，參與對病原的宿主免疫防御反應。同時，炎癥小體也與眾多無菌性慢性炎癥疾病發(fā)生密切相關。因此，解析炎癥小體激活的調控機制對防治炎癥性疾病發(fā)生具有重要意義。然而，是否像其他炎癥反應通路炎癥小體激活也存在精密高效的負反饋調控機制目前尚不可知。

2022年11月2日，南京醫(yī)科大學楊碩課題組和南京中醫(yī)藥大學胡剛/王冰微課題組合作，在PNAS雜志發(fā)表題為“The Gasdermin D N-terminal fragment acts as a negative feedback system to inhibit inflammasome-mediated activation of Caspase-1/11”的研究論文，揭示了固有免疫細胞焦亡效應分子GSDMD負反饋調控炎癥小體激活的作用及其分子機制，為靶向炎癥小體Caspases抗炎藥物開發(fā)提供了新線索。南京醫(yī)科大學姑蘇學院博士后胡穎超，生殖醫(yī)學國家重點實驗室和基礎醫(yī)學院博士研究生姜玉瑩和已畢業(yè)博士研究生李晟為本文的共同第一作者，南京醫(yī)科大學楊碩教授和南京中醫(yī)藥大學胡剛教授、王冰微教授為本文的共同通訊作者。
 

研究材料
體外研究使用了原代骨髓來源巨噬細胞（BMDM），永生化骨髓來源巨噬細胞（iBMDM），HEK293T細胞，體內研究中研究人員構建了髓系特異性GSDMD N端敲入小鼠（GSDMD N端Knockin小鼠由賽業(yè)公司提供）。

技術方法
蛋白印跡，F(xiàn)AM熒光探針，分子對接，免疫共沉淀，蛋白體外表達與純化，流式細胞術等。

技術路線

研究結果
研究人員通過骨髓來源巨噬細胞（BMDM）炎癥小體激活實驗，意外發(fā)現(xiàn)焦亡效應分子GSDMD缺失后炎癥小體激活顯著增強，提示GSDMD可能負反饋調控上游炎癥小體激活。

圖1 GSDMD負反饋調控炎癥小體激活^[9]

隨后研究人員采用分別穩(wěn)定表達GSDMD全長、N端、C端的永生化的骨髓來源巨噬細胞（iBMDM），進一步證實GSDMD活化產(chǎn)生的N端片段可特異性抑制炎癥小體蛋白酶Caspase-1/11激活，進而發(fā)揮負反饋調節(jié)作用。

圖2 GSDMD通過N端發(fā)揮負反饋調控效應^[9]

隨后，研究人員構建了帶有LSL表達盒的GSDMD N端序列Knockin小鼠（GSDMD-N^LSL，由賽業(yè)生物提供），與LysM-Cre工具鼠配繁，得到GSDMD N端片段髓系特異性敲入小鼠（GSDMD-N^LSL; LysM-Cre）。通過構建小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的多發(fā)硬化癥模型在體內水平驗證了GSDMD N端片段負反饋抑制效應。
 

圖3 GSDMD N端抑制NLRP3炎癥小體激活進而緩解EAE發(fā)生^[9]

為了解GSDMD N端抑制CASP1/11活性的結構基礎，研究人員接下來運用分子對接方法并結合體外實驗，發(fā)現(xiàn)GSDMD N端β1-β2環(huán)區(qū)段RFWK基序可通過疏水鍵和氫鍵等結合Caspase-1/11酶L1-L4口袋，進而干擾Caspase酶催化活性中心。

圖4 GSDMD N通過β1-β2區(qū)段RFWK基序結合抑制CASP1/11^[9]

最后，研究人員設計了基于RFWK基序的小分子多肽抑制藥物Ac-RFWK-CMK。Ac-RFWK-CMK可以抑制Caspase-1/11的活化及其下游底物GSDMD和IL-1β的剪切，以及脂多糖誘導的小鼠膿毒癥。

圖5 Ac-RFWK-CMK抑制Caspase-1/11剪切和炎癥小體激活^[9]

研究結論
綜上，該研究首次揭示了炎癥小體下游的負反饋調控機制，發(fā)現(xiàn)焦亡效應分子GSDMD可通過活化產(chǎn)生的N端片段β1-β2環(huán)RFWK基序作用炎癥小體蛋白酶Caspase-1/11酶催化中心，進而控制炎癥小體Caspase的過度激活和炎癥反應發(fā)生。

該研究拓展了我們對GSDMD蛋白功能的認識，為靶向炎癥小體Caspases的抗炎藥物開發(fā)提供了新線索。

參考文獻：
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[7] Shembade, N., A. Ma, and E.W. Harhaj, Inhibition of NF-kappaB signaling by A20 through disruption of ubiquitin enzyme complexes. Science, 2010. 327(5969): p. 1135-9.

[8] Carow, B. and M.E. Rottenberg, SOCS3, a Major Regulator of Infection and Inflammation. Front Immunol, 2014. 5: p. 58.

[9] Yingchao Hu, Yuying Jiang, Sheng Li, et al.The Gasdermin D N-terminal fragment acts as a negative feedback system to inhibit inflammasome-mediated activation of Caspase-1/11. PNAS. November 2, 2022. doi: 10.1073/pnas.2210809119
 

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Gsdmd基因敲除小鼠

品系名稱：
C57BL/6N-Gsdmd^em1Cya
品系編號：
KOCMP-69146-Gsdmd-B6N-VA
產(chǎn)品編號：
S-KO-12963
應用方向：
發(fā)育生物學,免疫系統(tǒng),生理系統(tǒng),造血系統(tǒng),細胞生物學,分子生物學
打靶方案：