新冠變異株如何逃避免疫應(yīng)答？人ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠助力揭示免疫逃逸機制

近期，國家衛(wèi)健委發(fā)布了兩條消息，一是將新型冠狀病毒肺炎更名為新型冠狀病毒感染；二是對新型冠狀病毒感染實施“乙類乙管”，隨著全國各地陸續(xù)放寬限制，新冠病毒感染人數(shù)直線激增，中國進入“共存時代”。新冠病毒（SARS-CoV-2）為什么難以對付？這是由于在自然感染和疫苗接種帶來的免疫壓力下，病毒出現(xiàn)了多個變異株，能夠逃避抗體的中和作用。

帶有L452R突變的Delta變異株出現(xiàn)后，已迅速取代Alpha、Beta、Gamma和Kappa等變異株成為全球主要的流行毒株。早期流行的Omicron變異株BA.1對抗體敏感，但包含L452R的亞型迅速出現(xiàn)并擴散至全球多個國家和地區(qū)。

廣州生物醫(yī)藥與健康研究院領(lǐng)導(dǎo)的研究團隊近日鑒定了SARS-CoV-2感染引起的群體免疫應(yīng)答，并探討了SARS-CoV-2變異株如何出現(xiàn)并逃避宿主的免疫應(yīng)答。這項成果于2022年9月下旬發(fā)表在《Nature Microbiology》雜志上。

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員從6例新冠康復(fù)期患者身上采集了全血樣本，并在Expi293F細胞和人ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠（由賽業(yè)生物提供）上開展實驗。他們構(gòu)建了噬菌體展示文庫，并分離出與刺突蛋白RBD結(jié)合的抗體。他們通過冷凍電鏡分析了抗原與抗體的結(jié)合，并通過生物膜干涉技術(shù)（BLI）測定了結(jié)合動力學(xué)和親和力以及競爭性結(jié)合。

技術(shù)路線
01 構(gòu)建噬菌體展示文庫并分離與刺突蛋白RBD結(jié)合的抗體
02 通過冷凍電鏡分析R1-32與刺突蛋白形成復(fù)合物的結(jié)構(gòu)
03 通過抗體與刺突蛋白突變體的結(jié)合分析RBD替換對免疫逃逸的影響
04 鑒定SARS-CoV-2感染引起的群體免疫應(yīng)答

研究結(jié)果
1.抗體R1-32中和了SARS-CoV-2變異株
研究人員對6例新冠恢復(fù)期患者外周血單核細胞中的抗體基因進行噬菌體展示，分離出6種與刺突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）具有高親和力的抗體。他們發(fā)現(xiàn)，R1-32抗體表現(xiàn)出最強的假病毒中和活性（IC90=9.95nM）。R1-32對Beta變異株和Omicron BA.1假病毒都保持了良好的中和作用，但對Delta變異株的中和作用被大大削弱。在人ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠（由賽業(yè)生物提供）上開展的實驗表明，R1-32對SARS-CoV-2野生型病毒感染具有保護作用。

通過冷凍電鏡分析，研究人員發(fā)現(xiàn)R1-32 Fab從刺突蛋白N端結(jié)構(gòu)域（NTD）的上方接近并與RBD結(jié)合。通過改變Fab的量，他們發(fā)現(xiàn)R1-32結(jié)合促進RBD打開。后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，R1-32的HCDR2和HCDR3介導(dǎo)了它與RBD的互作（圖1）。HCDR2表位包含疏水殘基L452、F490和L492，而多個新冠病毒變異株的HCDR2表位發(fā)生氨基酸替換，使R1-32與RBD結(jié)合的親和力大大降低，表明HCDR2表位內(nèi)的L452和F490對抗體結(jié)合極其重要。
 

圖1 R1-32與SARS-CoV-2刺突蛋白形成復(fù)合物的結(jié)構(gòu)

 
當(dāng)RBD處于down構(gòu)象時，R1-32表位被部分掩蓋，只有HCDR2表位完全暴露。這個半隱蔽的表位解釋了為什么R1-32結(jié)合促使RBD采用up構(gòu)象。進一步分析發(fā)現(xiàn)，與R1-32孵育的天然刺突蛋白分解成較小的結(jié)構(gòu)，表明R1-32結(jié)合產(chǎn)生了不穩(wěn)定的開放刺突蛋白結(jié)構(gòu)。研究人員認為，R1-32很有可能通過破壞刺突蛋白的結(jié)構(gòu)來抑制病毒細胞進入，從而中和病毒。

此外，他們發(fā)現(xiàn)R1-32及相關(guān)的FC08和52抗體均使用VH1-69基因作為重鏈可變區(qū)。它們以非常相似的方式與RBD結(jié)合，代表了一類獨特的RBD靶向抗體。

2.L452的RBD替換與免疫逃逸有關(guān)
Delta變異株（L452R/T478K）在印度出現(xiàn)后取代Kappa等多個變異株成為流行毒株。研究人員發(fā)現(xiàn)，Delta變異株中的T478K對抗體結(jié)合沒有影響，而L452R大大降低了R1-32和FC08與RBD的結(jié)合。基于這些結(jié)果，他們假設(shè)HCDR2表位452位點的替換可以逃避R1-32樣抗體。

最早出現(xiàn)的Omicron變異株BA.1在452和490位不包含任何替換，與此一致，他們發(fā)現(xiàn)R1-32與Omicron BA.1 RBD/刺突蛋白三聚體以高親和力結(jié)合，并中和Omicron BA.1假病毒。

研究人員推測R1-32樣抗體可能在人群中很常見，于是搜索了20名COVID-19患者和25名健康供體的免疫球蛋白重鏈（IgH）庫。他們在50%的COVID-19患者和24%的健康供體中檢測到R1-32樣IgH序列。COVID-19患者IGHV1-69編碼庫中的R1-32樣IgH序列百分比顯著高于健康供體，表明在暴露于SARS-CoV-2后該抗體譜系有明顯的克隆擴增（圖2）。