細數(shù)RHO視網(wǎng)膜色素變性研究下的熱門基因及基因療法盤點

上回我們提到了一種“從小孔洞里看世界”的眼科疾病，即視網(wǎng)膜色素變性（Retinitis Pigmentosa, RP）。隨著病情加重，患者的視野會收窄變小至管狀，就像透過一個小孔洞看向四周，可見范圍十分有限，如此持續(xù)直至最終完全失明。作為一種慢性、遺傳性的視網(wǎng)膜退行性病變，RP相關的致病基因就有近百個，包括視紫紅質（Rhodopsin, RHO）、Usher綜合征2A（Usher syndrome 2A, USH2A）和視網(wǎng)膜色素變性GTP酶調控因子（Retinitis pigmentosa gtpase regulator, RPGR）等。

其中，RHO合成的視紫紅質與視覺電信號產生密切相關，該基因導致了約25％的顯性RP遺傳，是最早發(fā)現(xiàn)且最常見的顯性RP致病基因。

RHO致病機理
RHO基因定位于3q21-24，長度為6.952kb，包含4個內含子和5個外顯子，其編碼的視紫紅質蛋白主要在視桿細胞外節(jié)中表達，對于光信號轉導至關重要。大多數(shù)RHO突變導致視紫紅質在感光細胞中高表達水平，使得大量的突變蛋白細胞定位異常、聚集、蛋白質降解嚴重超負，造成感光細胞凋亡，不能行使正常的光信號轉導功能。RHO突變型RP患者多于20歲前出現(xiàn)首發(fā)癥狀。

目前對RHO基因突變的研究認為其致病機制主要為gain of function，包括影響了：（1）視紫紅質蛋白質折疊，造成內質網(wǎng)壓力以及蛋白質聚集體形成；（2）11-順式視黃醛結合，Ｇ蛋白偶聯(lián)活化，視紫紅質抑制蛋白的結合與內吞作用；（3）視紫紅質的細胞運輸，包括高爾基體后的運輸靶向外段上膜等。

RHO基因突變類型
目前有超過150個RHO基因突變被鑒定與顯性RP相關，其中錯義突變?yōu)橹鳌?/strong>RHO基因突變在歐美人群尤其是美國人群中突變率最高，而在亞洲人群中突變率較低。

P23H是第一個被發(fā)現(xiàn)的RHO基因突變，在美國患者中約占12%，而在其他國家人群患者中卻很少發(fā)現(xiàn)。P23H的RHO基因突變導致蛋白不能正確折疊，造成內質網(wǎng)壓力及細胞毒性，最終導致視桿細胞退化。視紫紅質蛋白末端的347編碼區(qū)則是另一個基因突變的熱點，有6個不同的突變類型：P347T、P347A、P347S、P347Q、P347L、P347R，其中P347L最常見，在顯性RP中突變率為3.6%，僅次于P23H，國內研究報道P347L是一個較常見突變位點^[2]。

RHO突變分為兩類：A類突變導致早期喪失夜間視力和整個視網(wǎng)膜的視桿功能異常；B類突變會導致更緩慢的疾病進展，患者至少在視網(wǎng)膜的某些部分將正常的視桿感光細胞保留到成年期。從臨床表型來看，P347L較P23H更嚴重^[10]。

由于受影響細胞的生存能力延長，B類突變患者更適合進行基因治療。對于顯性疾病，治療可能需要抑制突變等位基因以避免其抑制作用；或通過基因校正，使用基因編輯來同時實現(xiàn)基因擴增和突變抑制。幾乎所有特征化的RHO突變體都是顯性的，因此可能需要沉默突變等位基因以防止失明，同時需要增加正�；�因表達以便更好地治療疾病^[3]。

RHO現(xiàn)有基因療法盤點
動物模型的應用有助于推動RHO相關的潛在治療方法向臨床試驗進一步轉化，該基因突變導致的adRP嚙齒動物模型包括：含有T17M、P23H、S334X或P347S等突變的人源化大小鼠模型。目前，靶向RHO基因以治療RP的基因療法有siRNA、ASO、CRISPR等。

▶siRNA療法
文獻中出現(xiàn)siRNA療法，但未見管線，該療法是一種表達shRNA的載體（抑制突變基因表達）和另一種表達替換視紫紅質的載體（遞送正�；�因）對P347S和P23H轉基因小鼠進行視網(wǎng)膜下注射，其中，shRNA能導致人類P23H-RHO轉基因小鼠中視紫紅質的50%抑制。與未經(jīng)過治療的眼睛相比，用組合載體治療的眼睛的總視紫紅質含量增加了兩倍，并在治療后9個月內保護ERG反應^[11]。

▶ASO藥物
ProQR公司的ASO藥物QR-1123治療與P23H RHO突變相關的adRP的臨床試驗正在進行中（ClinicalTrials.gov標識符：NCT04123626），疾病模型為P23H轉基因大小鼠^[9]。ASO可以通過靶向特異性基因序列調控蛋白質表達。特異性ASO可能僅對特定突變患者群體有用，但由于ASO的開發(fā)比病毒介導的反義技術更容易，因此如果存在測試系統(tǒng)（動物模型或類器官模型），開發(fā)針對罕見突變的治療性ASO是可行的^[8]。

▶CRISPR基因編輯
有文獻表明shRNA療法中小鼠視覺功能出現(xiàn)部分改善，然而相關研究結果對比并非十分明顯，或因RHO為活躍基因，在mRNA水平上干擾調節(jié)蛋白質水平具有挑戰(zhàn)，故而基因組編輯技術成為RHO基因治療研究熱點。

張鋒創(chuàng)立的Editas公布了其體內基因編輯療法EDIT-103用于治療由于RHO突變導致的RP^[12]。EDIT-103是一種不依賴于突變的基于CRISPR/Cas9的基因編輯療法，使用雙AAV5載體遞送來敲除和替換視紫紅質基因中的突變，以保持感光器功能，可通過視網(wǎng)膜下注射給藥。該療法有望解決150多種可導致RHO adRP病的RHO功能獲得型的突變。CRISPR療法的相關文獻中使用到的小鼠模型有P23H、P347S轉基因小鼠，hRHOC110R/WT人源化小鼠，同時具有多個突變的人源化小鼠模型等^[4,5,6,7]。不難發(fā)現(xiàn)，CRISPR療法中，疾病模型攜帶人突變基因是重要的共同因素，且人源化疾病模型小鼠在CRISPR治療中地位越來越重要。

基于自主研發(fā)的TurboKnockout融合BAC重組的技術創(chuàng)新，賽業(yè)生物可以提供RHO人源化及熱點突變人源化小鼠，以滿足廣大研發(fā)人員關于RP疾病的藥效學等實驗需求。

眼科基因治療動物模型推薦
在RHO基因突變導致的RP中，可應用的基因療法較多，且目前大多基因治療處于臨床前期，發(fā)展前景樂觀。關于研發(fā)階段中所使用到的動物模型，人源化小鼠無疑是大多數(shù)科研及藥企人員更青睞的選項，相信賽業(yè)生物為此布局的RHO人源化及熱點突變人源化小鼠能帶來更多的助力。