細(xì)小病毒B19探針法熒光定量PCR試劑盒使用說明書

產(chǎn)品及特點(diǎn)：
細(xì)小病毒B19(Parvovirus B19)引起的典型疾病是傳染性紅斑和急性關(guān)節(jié)病，在妊娠婦女可引起胎兒水腫乃至死胎。因此快速靈敏檢測(cè)細(xì)小病毒B19有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)細(xì)小病毒B19的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

■即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。

■引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

■提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

■特異性高，引物是根據(jù)細(xì)小病毒B19高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他病毒的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

■本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng)。

■本產(chǎn)品只能用于科研。

 

成分	編號(hào)	五孔盒包裝
2×Probe qPCR MagicMix	190303	500 μL（本色蓋）
熒光PCR專用模板稀釋液	180701	1 mL（紅蓋）
超純水	100935	1 mL（紫蓋）
細(xì)小病毒B19探針法qPCR引物-探針混合液	yp15-30900	150 μL（棕色管）
細(xì)小病毒B19探針法qPCR陽性對(duì)照(1×10E7拷貝/μL)	pc30900	50 μL（黃蓋）
使用手冊(cè)	15-30900sc	1份

運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月。

自備試劑
樣品DNA。

使用方法
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對(duì)照。

■標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2，1。

■用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。

■在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

■換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

■換槍頭，在4號(hào)管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

■重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

■如果有N個(gè)樣品待提取，最好設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的是PC（樣品制備陽性對(duì)照）和NC（樣品制備陰性對(duì)照）�？梢匀￡栃詫�(duì)照的10000倍稀釋液10μL再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規(guī)定體積一致，以此作為PC。另外用水作為NC。

■用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒DNAout。

三、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

■如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽性對(duì)照（用第4號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

■在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

成分	樣品管 N+2個(gè)	PCR陰性對(duì)照管	標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管（1-6管）
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各10 μL
細(xì)小病毒B19探針法qPCR引物-探針混合液	3 μL	3 μL	各3 μL
N+2個(gè)待測(cè)DNA模板	7 μL	-	-
超純水	-	7 μL	-
第6步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（1-6號(hào)）	-	-	各7 μL（1號(hào)樣到1號(hào)管，2號(hào)樣到2號(hào)管…）

■蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：

過程	溫度	時(shí)間
預(yù)變性	95℃	5 min
PCR反應(yīng) （45個(gè)循環(huán)）	95℃	15sec
	60℃	60sec（采集FAM通道的熒光信號(hào)）
按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行熔解曲線分析

■如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。

■如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于35。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。