南模生物小鼠模型在構(gòu)建一種全新誘導(dǎo)型Cre重組酶系統(tǒng)的應(yīng)用

Cre-loxP介導(dǎo)的遺傳操作技術(shù)，廣泛應(yīng)用于譜系示蹤、基因異位表達(dá)和組織特異性基因敲除等研究，為了解器官發(fā)育、組織再生和疾病進(jìn)程中體內(nèi)細(xì)胞行為和基因功能提供了關(guān)鍵依據(jù)。然而，Cre-loxP介導(dǎo)的遺傳操作技術(shù)長(zhǎng)期存在的缺陷和不足，已成為阻礙特定基因功能研究的瓶頸。

目前存在的主要缺陷和不足表現(xiàn)在：持續(xù)活化的Cre敲除基因的效率較高，但敲除基因的時(shí)間點(diǎn)不可控，導(dǎo)致基因敲除可能發(fā)生在發(fā)育早期或非預(yù)期的實(shí)驗(yàn)時(shí)間窗。誘導(dǎo)型CreER雖具有時(shí)間可控性，提高了遺傳操作的精確度，但敲除基因效率較低。為了提高誘導(dǎo)型CreER的基因敲除效率，需要高劑量且多次給予tamoxifen誘導(dǎo)，這不僅對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠有毒副作用、長(zhǎng)期影響其健康狀況，而且會(huì)引起基因敲除以外的一些混淆的表型。

2月17日，The EMBO Journal在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）周斌團(tuán)隊(duì)的研究成果 Generation of a self-cleaved inducible Cre recombinase for efficient temporal genetic manipulation（封面文章）。該研究構(gòu)建了一種新的誘導(dǎo)型Cre重組酶，可通過(guò)自我剪切將誘導(dǎo)型CreER轉(zhuǎn)變成持續(xù)活化的Cre，實(shí)現(xiàn)時(shí)間可控的高效遺傳操作。

這種新型Cre重組酶結(jié)合了誘導(dǎo)型CreER和持續(xù)活化的Cre重組酶的優(yōu)點(diǎn)，既提高了重組效率又具有時(shí)間可控性，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)CreER和Cre重組酶介導(dǎo)的遺傳操作技術(shù)的缺陷，突破了長(zhǎng)期阻礙基因功能研究的瓶頸，可廣泛應(yīng)用于器官發(fā)育、組織再生和疾病進(jìn)程中的基因功能研究。
 

南模生物為該研究構(gòu)建了Npr3-sCreER,Npr3-CreER,Col1a2-sCreER, Col1a2-CreER, R26-LZLT小鼠模型。

為了彌補(bǔ)傳統(tǒng)CreER和Cre重組酶介導(dǎo)的遺傳操作技術(shù)存在的缺陷，周斌團(tuán)隊(duì)研究人員構(gòu)建了一種可自我剪切的誘導(dǎo)型CreER（self-cleaved inducible CreER, sCreER）重組酶，在ER表達(dá)盒的兩側(cè)插入兩個(gè)loxP位點(diǎn)，經(jīng)tamoxifen誘導(dǎo)后，sCreER重組酶入核與ER兩側(cè)的loxP位點(diǎn)發(fā)生重組，通過(guò)自我剪切的方式由誘導(dǎo)型CreER轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)活化的Cre重組酶。sCreER重組酶介導(dǎo)的遺傳操作，在降低tamoxifen用藥劑量、減少給藥次數(shù)、減輕對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠毒副作用的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)高效率且時(shí)間可控的基因敲除。

利用這種新型的Cre重組酶，研究人員構(gòu)建了心內(nèi)膜細(xì)胞表達(dá)的Npr3-sCreER和成纖維細(xì)胞表達(dá)的Col1a2-sCreER轉(zhuǎn)基因小鼠，并與傳統(tǒng)Npr3-CreER和Col1a2-CreER轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了比較。與易于重組的等位基因如R26-tdTomato發(fā)生重組時(shí)，sCreER與傳統(tǒng)CreER的重組效率無(wú)顯著差異。而與相對(duì)難以重組的R26-Confetti、R26-LZLT（周斌組新構(gòu)建的一種報(bào)告基因R26-loxP-ZsGreen-loxP-tdTomato）、R26-GFP或VEGFR2flox/flox等位基因發(fā)生重組時(shí)，sCreER的重組效率顯著高于傳統(tǒng)CreER。與傳統(tǒng)CreER相比，sCreER顯著提高了誘導(dǎo)基因表達(dá)或敲除的重組效率，能夠?qū)崿F(xiàn)時(shí)間可控且高效的體內(nèi)基因組修飾，將會(huì)推動(dòng)器官發(fā)育、組織再生和疾病進(jìn)程中特定細(xì)胞譜系的基因功能研究。
 

sCreER重組酶通過(guò)自我剪切由CreER轉(zhuǎn)變成Cre的原理圖

據(jù)悉，中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）周斌研究員是本文的通訊作者。此項(xiàng)研究還得到了南京醫(yī)科大學(xué)季勇教授、南方醫(yī)科大學(xué)喬增勇教授和香港中文大學(xué)呂愛(ài)蘭教授等的大力支持。

文章鏈接：
https://www.embopress.org/doi/pdf/10.15252/embj.2019102675