新冠靶點新視角三：免疫調(diào)節(jié)相關(guān)因子LY6E和CD209L

 

對于新型冠狀病毒的相關(guān)信息，我們一直在進行深入調(diào)研，希望能為科研助一臂之力。前面的推文中我們已經(jīng)提到了細胞因子風(fēng)暴、跨膜蛋白酶等在新型冠狀病毒入侵宿主時所發(fā)揮的作用，那么除了這些，還會有別的因子起作用嗎？它們又扮演著怎樣的角色呢？根據(jù)調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)LY6E和CD209L兩類免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白在病毒與宿主受體作用時發(fā)揮了作用，下面進行詳細說明。

 

LY6E

 

LY6E與病毒相關(guān)的研究從2000年才開始逐漸發(fā)展起來，2001年報道了LY6E在一種致癌性禽皰疹病毒引起的馬立克氏病中的差異表達。之后研究發(fā)現(xiàn)LY6E蛋白可以增加宿主對于I型小鼠腺病毒（MAV-1）以及HIV-1的易感性，除了這些，LY6E還與許多RNA病毒的感染增強有關(guān)，比如黃熱病病毒（YFV）、登革熱病毒（DENV）、寨卡病毒（ZIKV）、甲型流感病毒（IAV）等。在機理研究方面，已有研究證明GPI錨定的蛋白與細胞骨架重排相關(guān)，如果LY6E參與了骨架重排，那么這對病毒進入細胞來說也是非常關(guān)鍵的，也就是說，LY6E分子有可能參與了病毒顆粒被宿主細胞內(nèi)化的過程。

 

LY6E對病毒感染的作用機制是怎樣的呢？有直接作用和間接作用，這取決于LY6E如何調(diào)節(jié)病毒感染，以哪種類型的細胞感染以及病毒本身的特異性：

 

● 首先，LY6E是GPI錨定的蛋白質(zhì)，富含脂筏微結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)內(nèi)吞運輸和信號傳導(dǎo)等膜依賴性過程，可以影響病毒糖蛋白或受體蛋白的表達及生物學(xué)特性，從而影響病毒與受體的結(jié)合、運輸以及膜融合。在HIV-1的研究中，已經(jīng)表明LY6E是通過調(diào)節(jié)病毒半融合狀態(tài)來促進病毒融合并增強其進入細胞的能力。

 

● 其次，GPI錨定的LY6蛋白可以調(diào)節(jié)細胞骨架的重排，從理論上講，GPI錨定的蛋白質(zhì)可能不會與細胞骨架分子直接發(fā)生相互作用，因為它們無法進入細胞內(nèi)部，而正因為這樣，這些蛋白質(zhì)可以與多種跨膜分子關(guān)聯(lián)，例如Src家族激酶和整合蛋白，這種間接的相互作用可以調(diào)節(jié)細胞骨架的結(jié)構(gòu)，也就是說，LY6E對不同病毒的感染力增強或者減弱，很大程度是由LY6E對細胞骨架重排上的影響造成的，具體是增強還是減弱，可能還跟細胞類型和病毒本身的特異性相關(guān)。

 

● 第三方面，LY6E可以調(diào)節(jié)包括宿主免疫應(yīng)答在內(nèi)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這對病毒感染的預(yù)防非常重要。我們都知道，細胞因子、趨化因子等參與了IFN-I信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過一系列的信號級聯(lián)反應(yīng)促使機體對病原體的清除。研究表明，細胞表面的LY6E的抗體交聯(lián)激活了T細胞，而T細胞的生理活性會影響到病毒的感染和存活。Yeom等人的研究表明LY6E可以通過PTEN/PI3K/Akt/HIF-1軸來調(diào)節(jié)腫瘤的生長，特別是在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)PTEN而上調(diào)HIF-1α基因。LY6E和LY6K還可以通過改變TGFβ依賴性的乳腺癌細胞的生理機制而參與乳腺癌的增殖，而TGFβ廣泛參與病毒感染和發(fā)病機制，研究證實，LY6E與先天性免疫信號之間可直接相互作用，LY6E下調(diào)CD14，而CD14是TLR4/CD14/NF-κB通路的關(guān)鍵分子，這會導(dǎo)致先天性免疫激活產(chǎn)生負(fù)反饋回路，為病毒的感染提供了新的路徑。需要指出的是，LY6E是質(zhì)膜靶向蛋白，但也可以在細胞內(nèi)表達。

 

有趣的是，Katrina B. Mar等人通過抗病毒ISG篩選，發(fā)現(xiàn)LY6E增強了病毒感染，研究結(jié)果顯示，在不同細胞中易位表達LY6E增強了多種RNA病毒的感染性，LY6E不會損害IFN的抗病毒活性或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但是會促進病毒進入細胞。

 

2020年3月5日瑞士伯爾尼大學(xué)病毒學(xué)與免疫學(xué)研究所Stephanie Pfaender等發(fā)現(xiàn)LY6E可以破壞冠狀病毒與宿主細胞融合，并調(diào)控免疫進程。這篇文章發(fā)表在bioRxiv上。冠狀病毒具有廣泛的宿主嗜性，有越過物種壁壘感染人類的能力，哺乳動物的先天免疫應(yīng)答有部分是通過干擾素來控制的，干擾素誘導(dǎo)多個基因來抑制病毒感染，其中就包括LY6E。而在人類、恒河猴、小鼠、蝙蝠和駱駝來源的LY6E直向同源物的比對解釋了物種間的強保守性。這篇研究展示了LY6E有效地限制了由多個冠狀病毒引起的細胞感染，包括SARS-CoV，SARS-CoV-2和MERS-CoV，研究表明，LY6E通過干擾spike蛋白介導(dǎo)的膜融合來抑制冠狀病毒進入細胞。在實驗中，研究者用到了造血干細胞中缺乏Ly6e的小鼠和Ly6e基因敲除小鼠，二者都極易受到冠狀病毒的感染，且發(fā)病程度加劇，伴隨著肝、脾臟免疫細胞的丟失和整體抗病毒感染途徑的減少等現(xiàn)象的出現(xiàn)。

 

對于LY6E在冠狀病毒中的研究我們還需要進一步去證實，鑒于該基因目前的功能，我們對SARS-CoV-2又有了新的了解，對抗病毒藥物的研發(fā)無疑又是一個新的啟發(fā)。

 

L-SIGN（CD209L）

 

C型凝集素是在抗原呈遞細胞上的跨膜蛋白，能夠以鈣依賴性的方式對糖類復(fù)合物中的碳水化合物進行特異性識別。在免疫反應(yīng)過程中C型凝集素介導(dǎo)細胞間的相互作用，識別內(nèi)源性受體，并且維持內(nèi)源性糖蛋白的穩(wěn)態(tài)。DC-SIGN是一種在樹突狀細胞（DC）表面表達的C型凝集素，可與HIV和猿猴免疫缺陷病毒有效結(jié)合并傳播給易感細胞。C型凝集素還有一種是DC-SIGNR，也稱為L-SIGN和CD209L。在某些情況下，C型凝集素是病原體（包括病毒、細菌、寄生蟲和真菌）侵襲細胞的受體，最典型的是DC-SIGN，在未成熟的DC和巨噬細胞亞群中均有表達，而L-SIGN與DC-SIGN具有77%的氨基酸序列同源性，可感染淋巴結(jié)和肝竇內(nèi)皮細胞，與絲狀病毒、冠狀病毒、淋巴細胞性脈絡(luò)膜腦炎病毒等的感染相關(guān)。

 

Stefan Pohlmann等人在2001年時就發(fā)現(xiàn)了L-SIGN與DC-SIGN相似，可以與HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒等毒株結(jié)合，引起T細胞系和人外周血單核細胞的感染。Bashirova AA等在“樹突狀細胞特異性胞間黏附分子3（ICAM-3）與DC-SIGN相關(guān)蛋白在人肝竇內(nèi)皮細胞上高表達并促進HIV-1感染”的研究中表明，L-SIGN與DC-SIGN相比，對ICAM-3具有更高的親和力，通過與ICAM-3的結(jié)合，增強T細胞對HIV-1的敏感性。

 

病毒與L-SIGN的結(jié)合取決于碳水化合物的識別，而與病毒結(jié)合的黏附因子在多種內(nèi)皮細胞中的存在表明L-SIGN可以通過與不同器官內(nèi)皮細胞黏附分子結(jié)合而實現(xiàn)在細胞間的活動，使HIV-1能夠穿越某些器官的毛細血管內(nèi)皮以及在病毒呈遞中發(fā)揮作用，HIV包膜（Env）蛋白與細胞表面分子之間的相互作用決定了哪些細胞易受到病毒侵襲以及侵襲的效率。樹突狀細胞（DC）能夠幫助結(jié)合的病毒有效地傳到外周單核細胞，即使DC本身未受到感染或感染效率低下，也能導(dǎo)致單核細胞強烈的感染。Leah GiLlespie的研究發(fā)現(xiàn)，DC-SIGN和L-SIGN是促進人偏肺病毒（human metapneumovirus，HMPV）感染靶細胞的附著因子。Marzi等人的研究證明，SARS-CoV Spike糖蛋白的逆轉(zhuǎn)錄假病毒可以與DC-SIGN和CD209L結(jié)合，但不依賴于這些凝集素進入細胞，同時他們還證明了CD209L在肝竇內(nèi)皮細胞、Peyer‘s淋巴細胞、回腸末端絨毛固有層的毛細血管以及II型肺泡細胞和肺內(nèi)皮細胞中對SARS-CoV具有受體活性。

 

Jeffers SA等用編碼CD209L的cDNA轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細胞（CHO），發(fā)現(xiàn)這些細胞對SARS-CoV變得敏感，進一步的研究表明CD209L可能是SARS-CoV的一種弱受體，同時，研究還證明了CD209L對于hCoV229E來說，是一種比hAPN活性更弱的受體。而SARS-CoV可能通過S蛋白上的高甘露聚糖與質(zhì)膜上的CD209L結(jié)合，然后介導(dǎo)病毒進入宿主細胞。顯然，CD209L蛋白在病毒和宿主細胞表面起到了橋梁的作用。已經(jīng)有報告證明，樹突狀細胞上的DC-SIGN是埃博拉病毒、HIV-1和其他包膜病毒的附著因子，樹突狀細胞是專業(yè)的抗原呈遞細胞，可將病毒呈遞給巨噬細胞或者CD4+T細胞。

 

Dong P. Han等在對SARS進行研究的時候發(fā)現(xiàn)，DC-SIGN和L-SIGN介導(dǎo)的SARS病毒感染的關(guān)鍵位點是特定的天冬酰胺連接的糖基化位點，他們提到，S糖蛋白上的高甘露聚糖對DN/L-SIGN介導(dǎo)的病毒感染很重要，定點誘變分析已經(jīng)鑒定出S蛋白上7個關(guān)鍵的糖基化位點，分別是109，118，119，158，227，589和699位的天冬酰胺殘基，而我們知道，病毒S蛋白RBD結(jié)構(gòu)域與ACE2結(jié)合的氨基酸殘基位于318-510區(qū)域。從動物到人類分離的SARS-CoV編碼S蛋白氨基酸序列分析表明，糖基化位點N227和N699促進了人畜共患病的傳播。Zhi-Yong Yang等人的研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV的S糖蛋白可以通過pH依賴的方式介導(dǎo)細胞的內(nèi)吞作用使病毒進入。2008年香港學(xué)者US Khoo等表明L-SIGN的多肽區(qū)域變體的雜合表達可能會改變病毒與配體的結(jié)合能力，而炎性因子在SARS感染中同樣起作用，這些都有助于增加SARS的易感性。Vera S F Chan等發(fā)現(xiàn)，與L-SIGN雜合的細胞相比，L-SIGN純和的細胞顯示出更高的與SARS-CoV結(jié)合的能力，更高的蛋白酶體依賴性病毒降解能力和更低的反式感染能力，因此，他們認(rèn)為，L-SIGN的純和性在SARS感染期間對機體起保護作用。

 

另外，也有研究表明，肺表面活性蛋白D（SP-D），該C型凝集素超家族成員包含與CD209L類似的碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域，是一種重要的宿主先天防御分子，可與細菌和病毒表面的高甘露聚糖結(jié)合，被SP-D包被的細菌和病毒形成聚集體，被巨噬細胞吞噬，由于可溶性CD209L可以與hCoV-229E病毒體結(jié)合并增強病毒與受體細胞的結(jié)合，因此SP-D也可能與hCoV-229E結(jié)合并介導(dǎo)病毒的黏附、侵入以及最終進入巨噬細胞和II型肺泡細胞。此外，肺泡表面活性劑在保護肺方面的作用不容小覷，它可以通過中和過度炎癥反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的氧化自由基，來達到保護目的。因此，SP-D為藥物研發(fā)方面也提供了一種非常有用的途徑。

 

綜上所述，我們對SARS-CoV-2的研究，需要從更廣泛的角度去理解病毒與受體之間的結(jié)合方式，才能在更深入的了解病毒的特征基礎(chǔ)上做出針對性的抗病毒制劑。共同攻堅，我們一起努力。

 

 

參考文獻：

1. Godfrey DI, Masciantonio M, Tucek CL, Malin MA, Boyd RL, Hugo P. Thymic shared antigen-1.

2. A novel thymocyte marker discriminating immature from mature thymocyte subsets. J Immunol. 1992.

3. Mao M, Yu M, Tong JH et al. RIG-E, a human homolog of the murine Ly-6 family, is induced by retinoic acid during the difffferentiation of acute promyelocytic leukemia cell. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996.

5. Schoggins JW, Wilson SJ, Panis M et al. A diverse range of gene products are effffectors of the type I interferon antiviral response. Nature. 2011.

6. Mar KB, Rinkenberger NR, Boys IN et al. LY6E mediates an evolutionaryly conserved enhancement of virus infection by targeting a late entry step. Nat Commun. 2018.

7. Yeom CJ, Zeng L, Goto Y et al. LY6E: A conductor of malignant tumor growth through modulation of the PTEN/PI3K/Akt/HIF-1 axis. Oncotarget. 2016.

8. Reed, S.G. TGF-β in infections and infectious diseases. Microbes Infect. 1999.

9. Xu X, Qiu C, Zhu L et al. IFN-stimulated gene LY6E in monocytes regulates the CD14/TLR4 pathway but inadequately restrains the hyperactivation of monocytes during chronic HIV-1 infection. J Immunol. 2014.

10. Jingyou Yu and Shan-Lu Liu. Emerging role of LY6E in virus-host interactions. Viruses. 2019.

11. Stephanie Pfaender, Katrina B. MAR, Eleftherios Michailidis et al. LY6E impairs coronavirus fusion and confers immune control of viral disease. bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.05.979260.

12. Katrina B. Mar, Nicholas R. RinKenberger, Ian N. Boys et al. LY6E mediates an evolutionarily conserved enhancement of virus infection by tergeting a late entry step. Nature communications. 2018.

13. Leah Gillespie, Kathleen Gerstenberg, Fernanda Ana-Sosa-Batiz et al. DC-SIGN and L-SIGN are attachment factors that promote infection of target cells by human metapneumovirus in the presence or absence of cellular glycosaminoglycans, Journal of virology. 2016.

14. Masayuki Shimojima, Atsushi Takenouchi et al.Distinct usage of three C-type lectins by Japanese encephalitis virus: DC-SIGN, DC-SIGNR, and LSECtin[J]. Archives of Virology, 2014, 159(8):2023-2031.

15. Arch virol. van den Berg LM, Gringhuis SI, Geijtenbeek TBH. Japanese encephalitis virus: DC-SIGN, DC-SIGNR, and LSECtin. An evolutionary perspective on C-type lectins in infection and immunity. Ann N Y Acad Sci. 2012.

16. Le Nouen C, Munir S, Losq S et al. Infection and maturation of monocyte-derived human dendritic cells by human respiratory syncytial virus, human metapneumovirus, and human parainflfluenza virus type 3. Virology. 2009.

17. Cox RG, Livesay SB, Johnson M, Ohi MD, Williams JV. The human metapneumovirus fusion protein mediates entry via an interaction with RGD-binding integrins. J Virol. 2012.

18. Wei Y, Zhang Y, Cai H et al. Roles of the putative integrin-binding motif of the human metapneumovirus fusion (F) protein in cell-cell fusion, viral infectivity, and pathogenesis. J Virol. 2014.

19. Cox RG, Mainou BA, Johnson M et al. Human metapneumovirus is capable of entering cells by fusion with endosomal membranes. Plos pathog. 2015.

20. Jeffers SA, Hemmila EM, Holmes KV. Human coronavirus 229E can use CD209L (L-SIGN) to enter cells. Adv Exp Med Biol. 2006.

21. A. Marzi, T. Gramberg et al. DC-SIGN and DC-SIGNR interact with the glycoprotein of Marburg virus and the S protein of severe acute respiratory syndrome coronavirus. J. Virol. 2004.

22. Vera S F Chan, KelVin Y K Chan, Yongxiong Chen et al. Homozygous L-SIGN (CLEC4M) plays a protective role in SARS coronavirus infection. Nature genetics. 2005.

23. US Khoo, KY Chan, VS Chan et al. Role of polymorphisms of the inflammatory response genes and DC-SIGNR in genetic susceptibility to SARS and other infections. Research fund for the control fo infectious diseases. 2008.

24. Zhiyong Yang, Yue Huang, Lakshmanan Ganesh et al. pH-Dependent entry of severe acute respiratory syndrome coronavirus is mediated by the spike glylcoprotein and enhanced by dendritic cell transfer through DC-SIGN. Journal of virology. 2004.

25. Dong P. Han, Motashim Lohani and Michael W. Cho. Specific asparagine-linked glycosylation sites are critical for DC-SIGN- and L-SIGN-Mediated severe acute respiratory syndrome coronacirus entry. Journal of virology. 2007.

26. Scott A. Jeffers, Sonia M. Tusell, Laura Gillim-Ross et al. CD209L (L-SIGN) is a receptor for severe acute respiratory syndrome coronavirus. PNAS. 2004.

27. Stefan Pohlmann, Elizabeth J, Soilleux, Frederic Baribaud et al. DC-SIGNR, a DC-SIGN homologue expressed in endothelial cells, binds to human and simian immunodeficiency viruses and activates infection in trans. PNAS. 2001.