新冠中和抗體與疫苗研發(fā)常見(jiàn)的病毒學(xué)研究方式-中和抗體研究

童話(huà)里的故事都是騙人的，但每個(gè)人心中的童話(huà)是美好的，充滿(mǎn)著希望和期待。面對(duì)新冠病毒疫情時(shí)，正是這樣的希望支撐著大家不斷地堅(jiān)持和奮斗。7月份以來(lái)，科學(xué)家們通過(guò)自主研發(fā)、團(tuán)體合作，中和抗體藥物的開(kāi)發(fā)以及疫苗II期臨床實(shí)驗(yàn)獲得進(jìn)一步成功，讓人們更加期待在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中人類(lèi)與病毒的抗?fàn)幱袀�(gè)好的結(jié)果。

 

在此，我們將對(duì)中和抗體和疫苗設(shè)計(jì)的相關(guān)問(wèn)題進(jìn)行討論：中和抗體研究的意義？新冠疫苗目前的成果？我們?nèi)绾瓮ㄟ^(guò)模式動(dòng)物來(lái)驗(yàn)證疫苗的安全及有效性？

 

中和抗體研究

當(dāng)病毒侵入機(jī)體時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體對(duì)病毒進(jìn)行中和，減少病毒對(duì)機(jī)體的侵害，阻止病原微生物通過(guò)黏附靶細(xì)胞受體來(lái)入侵細(xì)胞。

 

一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于像新冠肺炎等甲類(lèi)傳染病的研究，需要在3級(jí)以上生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。但在病毒學(xué)研究的進(jìn)程中，研究者們發(fā)現(xiàn)，假病毒的應(yīng)用在探究病毒中和性抗體藥物以及疫苗的研究中大有用途，由于假病毒大多用于病毒展示沒(méi)有傳播能力等特質(zhì)，使得對(duì)相應(yīng)病毒研究的實(shí)驗(yàn)環(huán)境并不需要格外嚴(yán)格，只要在生物安全2級(jí)以上就可以操作。

 

對(duì)于冠狀病毒假病毒中和抗體的研究，我們還得從SARS說(shuō)起，早在2005年，SARS病毒突然爆發(fā)，搞得人們措手不及。雖然說(shuō)SARS病毒來(lái)去匆匆，使得很多相關(guān)研究被擱淺，但仍然有很多項(xiàng)目被執(zhí)行了下來(lái)，對(duì)我們應(yīng)對(duì)今天的SARS-CoV-2不無(wú)借鑒意義。首先，我們來(lái)看一下，2005年英國(guó)倫敦大學(xué)Robin A. Weiss教授團(tuán)隊(duì)在Emerging infectious Disease上發(fā)表的文獻(xiàn)：Longitudinally Profiling Neutralizing Antibody Response to SARS Coronavirus with Pseudotypes。文中指出，SARS-CoV棘突蛋白S是中和抗體的主要靶標(biāo)，通過(guò)構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒S相關(guān)假病毒，成功制備SARS-CoV的中和抗體，并發(fā)現(xiàn)該抗體對(duì)患者SARS-S蛋白具有中和反應(yīng)。這項(xiàng)研究對(duì)于自然感染過(guò)程中的中和抗體效價(jià)及疫苗臨床前評(píng)估具有重要的意義。同時(shí)，研究者在小鼠和倉(cāng)鼠中進(jìn)行的臨床前研究發(fā)現(xiàn)中和抗體可明顯抵御活病毒的攻擊，這些研究結(jié)果說(shuō)明，中和抗體藥物的研究在一定程度上可以抵抗病毒的侵襲。

 

我們?cè)侔褧r(shí)間拉回到2020年3月，中國(guó)醫(yī)科院病原微生物研究所在Nature Communication上發(fā)表研究論文，利用假病毒系統(tǒng)證明了SARS-CoV-2-S 蛋白在病毒入侵細(xì)胞時(shí)表現(xiàn)出哪些特征，并對(duì)其與SARS-CoV產(chǎn)生的免疫交叉反應(yīng)進(jìn)行了闡述。該研究使用慢病毒SARS-CoV-2-S假病毒系統(tǒng)，確定了Huh7、Vero81、LLCMK2、Calu3等細(xì)胞對(duì)于該系統(tǒng)易感，文中還詳細(xì)論述了病毒與受體ACE2結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞的途徑。我們知道，CoV S蛋白是典型的I類(lèi)病毒融合蛋白，需要蛋白酶切割來(lái)激活S蛋白的融合潛能，在病毒S蛋白的S1和S2之間進(jìn)行切割，根據(jù)病毒株和細(xì)胞類(lèi)型，CoV S蛋白可能會(huì)被一種或幾種宿主蛋白酶切割，包括弗林蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、跨膜絲氨酸蛋白酶2（TMPRSS-2）、TMPRSS-4或人氣道胰蛋白酶樣蛋白酶（HAT）。這些蛋白酶在靶細(xì)胞上的存在很大程度上決定了冠狀病毒是通過(guò)質(zhì)膜還是通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。

 

圖1. SARS-CoV-2-S假病毒侵入細(xì)胞

(Xiuyuan Ou et al. 2020)

 

研究進(jìn)一步使用可溶性hACE2的流式細(xì)胞術(shù)和競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)分析驗(yàn)證了SARS-CoV-2和SARS-CoV兩種病毒的S蛋白都以hACE2作為病毒結(jié)合的受體。

 

冠狀病毒S蛋白是病毒毒力的關(guān)鍵因子，是決定病毒毒力、組織嗜性和宿主范圍的關(guān)鍵部分，也是中和抗體和疫苗設(shè)計(jì)的主要靶標(biāo)。那么對(duì)于SARS-CoV-2-S與SARS-CoV-S產(chǎn)生的免疫交叉反應(yīng)是如何體現(xiàn)的呢？

 

圖2. SARS和COVID-19患者血清的有限交叉中和反應(yīng)

(Xiuyuan Ou et al. 2020)

 

研究發(fā)現(xiàn)康復(fù)的SARS患者的血清對(duì)SARS-CoV S假病毒顆粒的入侵表現(xiàn)出強(qiáng)烈抑制作用，并且對(duì)SARS-CoV-2 S假病毒顆粒具有適度的中和活性。

 

隨著時(shí)間的推移，7月份中和抗體的研究結(jié)果逐漸浮出水面，各種友好的結(jié)果讓我們對(duì)抗疫的未來(lái)充滿(mǎn)了信心。7月9日，北京大學(xué)基因組學(xué)先進(jìn)創(chuàng)新中心（ICG）和生物醫(yī)學(xué)先鋒創(chuàng)新中心（BIOPIC）等單位合作在Cell上發(fā)表文獻(xiàn)，通過(guò)對(duì)新冠肺炎康復(fù)患者的B細(xì)胞進(jìn)行高通量單細(xì)胞測(cè)序，鑒定出了針對(duì)SARS-CoV-2的有效中和抗體。

 

圖3. SARS-CoV-2中和抗體的產(chǎn)生

(Yunlong Cao et al. 2020)

 

研究通過(guò)高通量scRNA/VDJ-seq測(cè)序，鑒定了8,558個(gè)IgG1+抗原結(jié)合克隆型，從60名康復(fù)患者中發(fā)現(xiàn)14種有效的SARS-CoV-2中和抗體，還用SARS-CoV-2真病毒和SARS-COV-2 VSV假病毒系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其中最有效的中和抗體是BD-368-2，而且BD-368-2對(duì)感染SARS-COV-2的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出較強(qiáng)的治療和預(yù)防作用。同時(shí)，研究利用了生物信息學(xué)的分析方法，對(duì)單克隆抗體CDR3H結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，mAb中與SARS-CoV中和抗體m396高度相似的CDR3H結(jié)構(gòu)對(duì)SARS-CoV-2具有非常高的中和效力。

 

圖4. BD-368-2對(duì)感染SARS-CoV-2的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠有較高的治療和預(yù)防作用

(Yunlong Cao et al. 2020)

 

7月23日，中科院生物物理所王祥喜研究員與多個(gè)團(tuán)隊(duì)合作，通過(guò)噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了冠狀病毒抗體庫(kù)，經(jīng)過(guò)高通量篩選鑒定出了一株對(duì)β冠狀病毒具有廣譜中和能力的抗體H014。

 

圖5. 交叉中和抗體H014的驗(yàn)證

(Zhe Lv et al. 2020)

 

人源化單克隆抗體H014，通過(guò)與S受體結(jié)合域（RBD）結(jié)合，可有效地中和假病毒SARS-CoV-S PSV以及真病毒SARS-CoV-2。在hACE2小鼠模型中，H014的給藥可降低感染肺部的SARS-CoV-2病毒滴度，減輕肺部病理變化。

 

以上研究為我們提供了中和抗體篩選的方式以及相應(yīng)的驗(yàn)證結(jié)果，對(duì)抗病毒藥物的開(kāi)發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義，同時(shí)，為疫苗靶點(diǎn)的探索指明了方向。

 

新冠疫苗的研發(fā)進(jìn)展

截止7月21日，世界范圍內(nèi)已經(jīng)有25種新冠候選疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，其中至少有4種疫苗進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)。

 

疫苗是將病原微生物經(jīng)過(guò)人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制備的用于預(yù)防傳染病的自動(dòng)免疫制劑。傳統(tǒng)的疫苗分為人工主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫疫苗，人工主動(dòng)免疫疫苗分為三類(lèi)，一是滅活疫苗，二是減毒活疫苗，三是類(lèi)毒素疫苗。人工被動(dòng)免疫的方式有以下四種，一是抗毒，二是人免疫球蛋白制劑，三是細(xì)胞因子制劑，四是單克隆抗體制劑。兩種方式的免疫均能使機(jī)體增強(qiáng)抗病能力，減少傳染病的發(fā)生�？萍嫉倪M(jìn)步帶來(lái)了疫苗制備方式的創(chuàng)新，根據(jù)不同制備方式，目前已有的新型疫苗類(lèi)型有亞單位疫苗、結(jié)合疫苗、合成肽疫苗和基因工程疫苗（重組抗原疫苗/重組載體疫苗/DNA-RNA疫苗/轉(zhuǎn)基因植物疫苗）。

 

回到新冠疫苗的研究上，2020年7月14日，美國(guó)Moderna公司研發(fā)的候選疫苗mRNA-1273在100mg免疫劑量下可激發(fā)人體較好的中和抗體反應(yīng)和偏向于Th1 CD4型細(xì)胞免疫應(yīng)答，不良反應(yīng)相對(duì)溫和，后期的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行。7月20日，牛津大學(xué)和軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院陳薇院士團(tuán)隊(duì)腺病毒載體疫苗 ChAdOx1 nCoV-19（AZD1222）II期臨床結(jié)果揭曉，令人興奮的是，該研究評(píng)估了腺病毒Ad5載體的候選COVID-19疫苗的免疫原性和安全性，確定候選疫苗的合適劑量用于下一步的有效性研究。同在7月20日，德國(guó) BioNTech 公司聯(lián)合美國(guó)輝瑞等機(jī)構(gòu)在預(yù)印本網(wǎng)站medRxiv發(fā)布了RNA疫苗的1/2期臨床試驗(yàn)結(jié)果。通過(guò)脂質(zhì)納米顆粒處理的RNA疫苗能激發(fā)受試者細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，BNT162b1編碼SARS-CoV-2棘突蛋白的受體結(jié)合域（RBD），BNT162b1表達(dá)的RBD抗原與T4纖維蛋白衍生的“foldon”三聚結(jié)構(gòu)域融合，通過(guò)多價(jià)重組增加其免疫原性。

 

這些成果的展示，體現(xiàn)了科技的發(fā)展與人類(lèi)的進(jìn)步，但是在疫苗安全效用評(píng)估的過(guò)程中，我們不得不充分考慮到ADE（antibody-dependent enhancement）效應(yīng)的出現(xiàn)。

 

那么什么是ADE呢？早在1964年，Hawkes等在蟲(chóng)媒病毒的研究中提到了“抗體依賴(lài)性感染增強(qiáng)”的假說(shuō)，ADE主要表現(xiàn)為病毒在低濃度免疫血清中的復(fù)制被促進(jìn)而不是被抑制，這也是當(dāng)初登革熱出血癥和登革熱休克綜合癥產(chǎn)生的主要原因。而對(duì)于新冠病毒，是否也會(huì)出現(xiàn)這樣一種令人擔(dān)憂(yōu)的現(xiàn)象呢？

 

圖6. 冠狀病毒抗體反應(yīng)的潛在結(jié)果

a. 在抗體介導(dǎo)的病毒中和過(guò)程中，與病毒刺突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）以及其他結(jié)構(gòu)域結(jié)合的中和抗體可防止病毒黏附于受體ACE2上。

b. 在感染的抗體依賴(lài)性增強(qiáng)過(guò)程中，低質(zhì)量、少量和非中和性抗體會(huì)通過(guò)Fab結(jié)構(gòu)域與病毒顆粒結(jié)合。單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞上表達(dá)的Fc受體（FcR）與抗體Fc結(jié)構(gòu)域結(jié)合并促進(jìn)病毒的進(jìn)入和感染。

c. 在抗體介導(dǎo)的免疫增強(qiáng)過(guò)程中，低質(zhì)量、少量和非中和性抗體與病毒顆粒結(jié)合。Fc結(jié)構(gòu)域與受體結(jié)合后，F(xiàn)cR啟動(dòng)信號(hào)，促炎性細(xì)胞因子上調(diào)同時(shí)抗炎性細(xì)胞因子下調(diào)。免疫復(fù)合物和病毒RNA通過(guò)Toll樣受體3（TLR3）、TLR7或TLR8發(fā)出信號(hào)以激活宿主細(xì)胞，從而導(dǎo)致免疫病理學(xué)現(xiàn)象的發(fā)生。

 

研究表示，在SARS-CoV感染中，ADE是由于病毒與在不同免疫細(xì)胞（包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞）上表達(dá)的Fc受體（FcR）結(jié)合而發(fā)生的。預(yù)先存在的SARS-CoV特異性抗體可能會(huì)促進(jìn)病毒進(jìn)入表達(dá)FcR的細(xì)胞。實(shí)際上，通過(guò)ADE感染巨噬細(xì)胞不會(huì)導(dǎo)致有效的病毒復(fù)制和脫落。相反，病毒抗體免疫復(fù)合物的內(nèi)化可通過(guò)FcRs5激活髓樣細(xì)胞來(lái)促進(jìn)炎癥和組織損傷。通過(guò)此途徑進(jìn)入的病毒可能會(huì)與模式識(shí)別受體TLR3、TLR7和TLR8結(jié)合。巨噬細(xì)胞通過(guò)ADE吸附SARS-CoV病毒導(dǎo)致TNF和IL-6的產(chǎn)生升高。因此，在對(duì)疫苗進(jìn)行研發(fā)的過(guò)程中，我們不得不考慮可能出現(xiàn)的ADE效應(yīng)。那么，如何能夠最大限度地避免該現(xiàn)象在人體中發(fā)生，那就是疫苗應(yīng)用前的模式動(dòng)物安全性驗(yàn)證。

 

模式動(dòng)物應(yīng)用于疫苗安全性驗(yàn)證

6月份，趙金存教授團(tuán)隊(duì)研發(fā)制備腺病毒載體新冠小鼠模型，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該方法所制備的小鼠模型能夠產(chǎn)生有效的中和抗體，對(duì)疫苗和藥物評(píng)價(jià)具有非常重要的意義。同時(shí)，華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)部也利用AdV-hACE2模型制備了高效中和抗體，到7月份，疫苗的研究進(jìn)展相繼被報(bào)道，美國(guó)Moderna公司開(kāi)發(fā)的mRNA-1273和德國(guó)BioNTech等機(jī)構(gòu)研發(fā)的納米顆粒mRNA疫苗取得了有效進(jìn)展，激發(fā)了受試者產(chǎn)生免疫應(yīng)答并產(chǎn)生中和抗體。我國(guó)陳薇院士團(tuán)隊(duì)聯(lián)合牛津大學(xué)制備的腺病毒載體疫苗ChAdOx1 nCoV-19同樣產(chǎn)生了令人期待的好結(jié)果。

 

這些研究，無(wú)一不讓我們更加期待模式動(dòng)物的廣泛應(yīng)用。疫情給我們最深的體會(huì)大概就是，有史以來(lái)全民對(duì)病毒的了解恐怕沒(méi)有比新冠病毒更深入的了。隨著科技的進(jìn)步，全球醫(yī)療健康水平會(huì)進(jìn)入到一個(gè)新的階段，人們對(duì)生命本質(zhì)的了解會(huì)更加透徹。

 

童話(huà)很美好，我們的未來(lái)也可期。

 

賽業(yè)個(gè)性化ACE2小鼠：兩大技術(shù)、三大品系、多種打靶方案

 

賽業(yè)生物作為模式動(dòng)物領(lǐng)域的領(lǐng)軍企業(yè)，在新冠肺炎疫情爆發(fā)初期，便組織研發(fā)團(tuán)隊(duì)全力開(kāi)發(fā)新冠小鼠模型。我們利用自主研發(fā)的TurboKnockout技術(shù)和經(jīng)過(guò)優(yōu)化的CRISPR-Pro技術(shù)同步開(kāi)展BALB/c、C57BL/6J、C57BL/6N三種背景品系的人源化ACE2小鼠制備，并綜合考慮不同基因編輯方式的優(yōu)缺點(diǎn)，設(shè)計(jì)了多種基因打靶方案與構(gòu)建策略，以滿(mǎn)足您不同研究目的和不同應(yīng)用方向的需求。您可以查看次條推文了解具體的ACE2小鼠打靶方案，如有需要，歡迎后臺(tái)留言后者聯(lián)系我們咨詢(xún)~

 

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