揭秘神經(jīng)發(fā)育過程中m6A-RNA甲基化與組蛋白修飾間的關系

文章導讀
表觀轉錄組學的研究在生物發(fā)育和疾病相關性等方面正越來越引起人們的關注。其中m6A修飾的研究是表觀轉錄組學研究的一大熱點。研究表明，m6A標簽在mRNA和lncRNA中超過10,000種，并且m6A參與mRNA的轉錄后修飾也成為基因表達中的一種重要的調控機制。m6A的在基因表達調控方面功能作用已被廣 泛研究，但它在生物水平上發(fā)展的重要性仍在很大程度上不為人所知。

Nature neuroscience（IF=20.071）上一篇題目為N6-methyladenosine RNA modification regulates embryonic neural stem cell self-renewal through histone modifications的文章。本文結合m6A-seq, RNA-seq, ChIP-seq等多種技術探究了RNA甲基化修飾在調節(jié)組蛋白修飾終影響小鼠胚胎神經(jīng)干細胞的增殖與分化過程，為從表觀遺傳學層面調控胚胎神經(jīng)干細胞發(fā)育的研究提供了新的方向。小編今 天將對這篇結合了多種分子生物學研究手段的文章進行系統(tǒng)的解析。

發(fā)表期刊：Nature Neuroscience
影響因子：20.071
實驗方法:  m6A-seq, RNA-seq, ChIP（以上服務云序均可提供）
文章鏈接：N6-methyladenosine RNA modification regulates embryonic neural stem cell self-renewal through histone modifications
研究內容
(1) Mettl14基因敲除降低NSC增殖并促進NSC提前分化
作者利用基因工程技術獲得了正常小鼠Mettl14f/f（CK）、敲除Mettl14基因的純合小鼠Mettl14f/f;Nestin-Cre (Mettl14-cKO)和雜合小鼠Mettl14f/+;Nestin-cre。對這三組小鼠的神經(jīng)球進行體外培養(yǎng)，通過TLC分析不同組中的m6A水平，Mettl14-cKO中的m6A水平極低，得到進行m6A在NSC中功能研究的理想株系。作者進行了E14.5時期的體外神經(jīng)元培養(yǎng)，檢測Mettl14f/f、Mettl14f/f;Nestin-Cre 和Mettl14f/+;Nestin-cre的神經(jīng)元數(shù)量與大小，檢測到Mettl14-cKO中神經(jīng)元的大小為對照組的55%。對NSC細胞數(shù)量的統(tǒng)計證明了Mettl14-cKO的NSC的增殖能力明顯下降。通常細胞增殖力下降往往伴隨著細胞的分化提前，作者對三個株系的NSCs進行Tuj1（神經(jīng)元分化微管蛋白）染色，結果顯示Mettl14-cKO NSCsTuj1+是對照組的6.2倍。這些數(shù)據(jù)說明Mettl14-cKO相比于對照組NSCs的增殖水平下降且分化提前。 （2）Mettl14-cKO小鼠大腦皮層RGC池的大小減少并促進神經(jīng)干細胞分化

接著作者在E15.5 ，E17.5小鼠的大腦皮層進行不同標記染色，Mettl14-cKO中BrdU+（檢測細胞增殖的分子標記物）細胞較CK減少19%和40%；磷酸組蛋白H3 （PH3，有絲分裂標記物）的細胞減少44%和45%；Pax6+（胚胎發(fā)育中重要的調控因子）的數(shù)量減少了14%和45%。說明E15.5 ，E17.5時期Mettl14-cKO小鼠大腦皮層神經(jīng)干細胞的增殖能力下降，該結果與體外結果一致。

IdU（標記正在增殖的細胞）和BrdU皮質切片雙染色評估細胞周期進程，測定IdU+BrdU -的百分比（代 表增殖細胞和已經(jīng)離開s期的細胞）。E15.5和E17.5 Mettl14-cKO與CK相比，分別下降了38%和43%，表明Mettl14的丟失擾亂了正常的RGC細胞周期進程。E15.5和E17.5時期Mettl14-cKO小鼠的BrdU+Ki67-（標記增殖周期中的細胞）皮質切片染色信號分別減少50%和39%，說明正常RGC細胞增殖周期需要Mettl14的調節(jié)，Mettl14-cKO小鼠皮層RGC池明顯減少。

為評估伴隨著細胞增殖減緩，RGC在皮層中是否發(fā)生過早分化，作者用Tbr2（參與皮質細胞分化）和Neurod2 (ND2，神經(jīng)系統(tǒng)的細胞分化)對E15.5和E17.5時期Mettl14-cKO小鼠的大腦皮層進行檢測。在E15.5和E17.5時，在Mettl14-cKO小鼠大腦皮層始終可見ND2+Tbr2+細胞斑塊，但在相同階段的對照組小鼠中卻不存在。以上數(shù)據(jù)說明Mettl14-cKO小鼠大腦皮層RGC池的大小減少并伴隨著神經(jīng)干細胞提前分化。此結果與體外NSCs的發(fā)育特征一致。

（3）Mettl14缺失導致晚期出生神經(jīng)元數(shù)量減少

在P0小鼠中，作者通過特定標記識別相應的神經(jīng)元亞型，在六個不同的皮層中發(fā)現(xiàn)了RGCs分化的神經(jīng)元。其中，Cux1在晚期出生的神經(jīng)元中表達，是II-IV的標記物，對標記信號進行定量結果表明相比于CK小鼠而言Mettl14-cKO小鼠中Cux1+的信號值下降70%；Sox5是指在早期出生的神經(jīng)元中表達，是V層的標記，圖中結果顯示Mettl14-cKO與CK之間的Sox5+信號并無明顯區(qū)別；Tbr1表示在有絲分裂后的神經(jīng)元中表達，是VI的標記物，結果與Sox1類似，在Mettl14-cKO中也并無明顯變化。以上結果說明敲除mettl14基因之后，導致小鼠大腦皮層中晚期出生的神經(jīng)元的數(shù)量下降。 （4）RNA-seq分析敲除Mettl14導致組蛋白修飾在全基因組范圍內發(fā)生改變，從而影響基因表達
為了進一步明確敲除mettl14后小鼠大腦皮層出現(xiàn)NSCs增殖下降以及神經(jīng)元細胞提前分化的分子機理，作者對Mettl14-cKO、CK和雜合小鼠株系的NSCs細胞分別進行了RNA-seq。通過對RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)相比于CK和雜合株系，Mettl14-cKO中轉錄組表達發(fā)生明顯的變化。對發(fā)生變化的基因進行GO分析預測差異表達基因的功能，結果顯示上調的基因的潛在功能富集在與細胞分化相關功能，而下調的基因功能主要富集在與細胞增殖相關的基因功能。
大量研究表明，組蛋白修飾是哺乳動物細胞基因調控的關鍵機制，那么m6A是否能通過mRNA修飾來改變組蛋白修飾從而影響基因的表達呢？作者通過對NSCs Western Blots，評估了一組調控干細胞活性的組蛋白修飾，包括H3磷酸化，H2A和H2B泛素化，三種組蛋白乙�；�，四種組蛋白甲基化，這些組蛋白標記與基因激 活或抑 制有關。作者量化了western blots結果，發(fā)現(xiàn)H3K27ac位點在Mettl14-cKO中相比于CK增加了111%，H3K4me3位點增加了43%，H3K27me3增加了71%，說明m6A調節(jié)特異性組蛋白修飾。
為了確定這些變化是否會改變NSC的增殖，作者用抑 制組蛋白修飾上調的化學抑 制劑，以確定E14.5時期KO小鼠NSCs中抑 制組蛋白修飾上調是否會挽救細胞增殖缺 陷。其中MM102能抑 制H3K4me3的形成（抑 制MLL1基因）；C646能抑 制H3K27乙酰轉移酶Crebbp (CBP)/p300活性；GSK343抑 制H3K27me3的形成（抑 制Ezh2基因）。在DMSO處理后，Mettl14-cKO小鼠NSCs的數(shù)量是CK的50%，反映了預期的增殖緩慢。GSK343處理后將Mettl14-cKO與CK的比例提高，說明抑 制H3K27me3的形成可以回復增殖缺陷。在C646處理后，結果一樣能夠回復增殖缺陷。說明m6A至少可以通過H3K27me3和H3K27ac修飾調控NSC增殖。 為了確定H3K27me3和H3K27ac修飾的目標基因，作者對Mettl14-cKO和CK小鼠的NSCs細胞進行了H3K27me3和H3K27ac的 ChIP-seq實驗，通過對ChIP-seq結果與RNA-seq數(shù)據(jù)關聯(lián)分析，作者選擇了H3K27me3調控的5個與增殖相關的基因包括Egr2和Egr3，這些基因在Mettl14-cKO的轉錄組數(shù)據(jù)中相比于其在CK中的表達是明顯下調的，此外也選擇了H3K27ac調控的5個與分化相關的基因包括Kif26a38、Gas739和Pdgfrb40，在Mettl14-cKO的轉錄組數(shù)據(jù)中相比于其在CK中的表達是明顯上調的。其中，H3K27me3通常標記基因啟動子，與基因沉默相關，而H3K27ac富集于啟動子和增強子區(qū)，與基因激 活相關。那么在E14.5時期Mettl14-KO和CK的NSCs中增加H3K27me3的啟動子是否與基因下調相關，而啟動子/增強子H3K27ac的增加是否與基因上調相關？作者用H2K27ac抑 制劑(C646)或H3K27me3抑 制劑 (GSK343)處理細胞，C646處理明顯降低了Mettl14-cKO小鼠NSCs中神經(jīng)元分化調節(jié)因子Kif26a38、Gas739和Pdgfrb40的表達。而GSK343處理增加了轉錄因子Egr2和Egr3（促進細胞增殖)，說明m6A調控組蛋白修飾在NSC基因表達中的作用。上述結果表明，敲除Mettl14導致組蛋白修飾（H3K27me3和H3K27ac）在全基因組范圍內發(fā)生改變，從而影響與增殖相關或分化相關的基因表達。

 

（5）m6A調節(jié)H3K27乙酰轉移酶CBP和p300轉錄本的穩(wěn)定性
既然Mettl14-cKO小鼠中mettl14甲基化水平下降可以影響組蛋白位點（H3K27me3和H3K27ac）的修飾，那么是否調控組蛋白H3K27me3和H3K27ac位點修飾的酶的的轉錄本穩(wěn)定性是否受m6A調節(jié)呢？作者通過m6A-seq分別測定了H3K27乙�；�酶CBP/p300 mRNA和H3K27甲基化酶Ezh2/Eed/Suz12 mRNA上m6A修飾水平，結果發(fā)現(xiàn)在Mettl14-cKO中相比于CK小鼠而言，H3K27乙�；�酶CBP/p300 mRNA上有20-30%的m6A修飾位點丟失，但H3K27甲基化酶Ezh2/Eed/Suz12 mRNA上m6A修飾水平在Mettl14-cKO與CK小鼠中并沒有明顯差別。通過放線菌素D (ActD，抑 制轉錄）處理E14.5的KO小鼠的NSCs并在3h和6h后捕獲細胞來檢測mRNA的穩(wěn)定性，結果顯示，在Mettl14-KO中相比于CK，CBP和p300的mRNA穩(wěn)定性均明顯增強。上述結果表明m6A可以調節(jié)H3K27乙酰轉移酶CBP和p300轉錄本的穩(wěn)定性。 技術路線 總結
本文作者通過轉基因技術發(fā)現(xiàn)在敲除了mettl14基因的小鼠中NSC的增殖能力明顯下降并且表現(xiàn)出分化提前的現(xiàn)象，隨后作者通過RNA-seq分析了在Mettl14-cKO小鼠中的差異表達基因，并發(fā)現(xiàn)大部分與增殖相關的基因表達下調而與分化相關的基因表達上調m6A-seq發(fā)現(xiàn)調控H3K27ac組蛋白，隨后結合H3K27me3和H3K27ac的ChIP-seq，分別找到了5個受組蛋白修飾H3K27ac調控的與分化相關的上調基因和5個H3K27me3調控的與增殖相關的下調基因，之后通過修飾酶CBP和p300受m6A甲基化調控。通過上述一系列技術手段揭示了mettl14基因敲除后小鼠胚胎神經(jīng)干細胞的增殖下降和分化提前是由于m6A修飾CBP和p300的mRNA水平下降，導致CBP和p300表達上調，從而促進了H3K27乙酰化，H3K27ac又能夠上調分化相關基因的表達，從而導致分化提前，而m6A修飾通過未知機制促使H3K27me3，H3K27me3能夠抑 制增殖相關的基因下調，從而導致增殖受阻。該文章對m6A調控NSC的自我更新進行了邏輯清晰的闡述，其中將明確的科研思路與m6A-seq, RNA-seq, ChIP-seq等技術進行了完美的結合，為我們講述了一個完整的m6A與生物發(fā)育的故事。。。

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