脂肪酸FA在體內(nèi)參與吸收關(guān)鍵調(diào)控機制的重要作用

 

脂肪酸（FA）在體內(nèi)具有重要功能，可作為能量來源，并參與生物膜合成和能量存儲。然而，脂肪酸如何跨過細胞膜進入細胞內(nèi)，目前仍不太清楚。與葡萄糖和氨基酸不同，脂肪酸具有疏水性，這使得其運動難以追蹤。有人認為，脂肪酸是經(jīng)過被動擴散穿過細胞膜，但越來越多的證據(jù)表明，脂肪酸是在蛋白的參與下完成代謝組織的跨膜轉(zhuǎn)運。

 

在已知的脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白中，CD36是研究相對較多的一個。它主要定位于細胞膜上的caveolae凹陷結(jié)構(gòu)，且脂肪酸吸收活性也依賴caveolae結(jié)構(gòu)。小鼠脂肪和肌肉組織中大約50%的脂肪酸吸收是由CD36貢獻的。CD36有一個脂肪酸結(jié)合位點，但具體如何轉(zhuǎn)運脂肪酸，現(xiàn)在還是個謎。

 

復旦大學代謝與整合生物學研究院的趙同金課題組之前發(fā)現(xiàn)，兩個棕櫚�；�轉(zhuǎn)移酶DHHC4和DHHC5分別在高爾基體和細胞質(zhì)膜上對CD36進行棕櫚�；�修飾，從而維持CD36的質(zhì)膜定位并促進其脂肪酸吸收的活性。

 

最近，趙同金課題組與南京大學模式動物研究中心的陳帥課題組合作，進一步研究了CD36促進脂肪酸吸收的方式。他們發(fā)現(xiàn)，脂肪酸可通過CD36介導的內(nèi)吞作用轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)，而CD36的動態(tài)棕櫚酰化在這一過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這項成果發(fā)表在《Nature Communications》雜志上。

 

CD36介導的內(nèi)吞作用將脂肪酸轉(zhuǎn)運到細胞

為了研究脂肪酸吸收期間CD36的亞細胞定位變化，研究人員用BSA偶聯(lián)的油酸處理3T3-L1脂肪細胞，并開展內(nèi)源性CD36的免疫染色。他們發(fā)現(xiàn)，從油酸處理后30分鐘開始，CD36被內(nèi)化并在細胞內(nèi)顯示出點狀信號。到1小時，CD36開始包裹脂滴，并在2小時和4小時變得更明顯。

 

由于CD36主要定位在caveolae凹陷結(jié)構(gòu)上，故研究人員也分析了caveolae結(jié)構(gòu)蛋白Caveolin1（CAV1）的動態(tài)定位。他們發(fā)現(xiàn)CAV1與CD36共同遷移�？紤]到CD36的脂肪酸結(jié)合位點位于質(zhì)膜外側(cè)，而CAV1位于內(nèi)側(cè)，他們猜測CD36和CAV1在內(nèi)化時相互依賴，其中CD36作為受體接受脂肪酸的信號，而CAV1提供結(jié)構(gòu)上的支持。確實是這樣，當脂肪細胞中的任一個被敲除時，另一個在油酸處理后也不再內(nèi)化，這表明它們的內(nèi)化源于CD36介導的caveolae內(nèi)吞作用。

 

之后，他們選擇PacFA作為脂肪酸類似物來追蹤脂肪酸在細胞內(nèi)的運動。如圖1所示，PacFA是一種可以光活化的脂肪酸類似物，可參與點擊反應(yīng)。他們用PacFA處理脂肪細胞20分鐘，然后利用N3-Alexa Fluor 488開展點擊反應(yīng)以標記PacFA，并對CD36進行免疫染色。通過這種方式，他們觀察到了PacFA和CD36的清晰定位。在定量時，大約56%的PacFA與細胞內(nèi)部的CD36結(jié)合。

 

為了進一步確認CD36通過內(nèi)吞作用促進脂肪酸吸收，研究人員試圖敲除CAV1，看看對內(nèi)吞作用的阻斷是否會破壞脂肪酸吸收。他們在Cav1−/−小鼠（賽業(yè)生物提供）、 Cd36−/−小鼠以及 Cav1−/−;Cd36−/−小鼠的脂肪細胞中開展3H-油酸吸收實驗。與野生型脂肪細胞相比，Cav1−/−脂肪細胞中的3H-油酸吸收降低40%。同時，雙重敲除并沒有進一步降低3H-油酸的吸收，表明caveolar內(nèi)吞是CD36依賴的脂肪酸吸收所必需的。

圖1. CD36介導的caveolar內(nèi)吞將脂肪酸轉(zhuǎn)運到細胞

 

CD36的動態(tài)棕櫚酰化是脂肪酸吸收所必需的

之后，研究人員想了解CD36如何從質(zhì)膜上解離。由于CD36的質(zhì)膜定位需要棕櫚�；�，因此他們想看看CD36在內(nèi)化之前是否會去棕櫚酰化。在油酸處理后5分鐘內(nèi)，CD36的棕櫚�；�水平開始降低，并在30-60分鐘左右達到最低點。DHHC5的棕櫚�；�也有類似的觀察結(jié)果。從培養(yǎng)基中去除油酸時，CD36和DHHC5被重新棕櫚酰化，這表明CD36和DHHC5在脂肪酸誘導的內(nèi)吞過程中經(jīng)歷了棕櫚�；�的動態(tài)變化。

 

接著他們解析了CD36內(nèi)吞的信號通路。首先鑒定了CD36的去棕櫚�；�酶，目前主要有五種，包括APT1、APT2和ABHD17A–C。通過PalmB抑制等實驗，他們發(fā)現(xiàn)APT1是CD36的去棕櫚�；�酶。然后，他們敲除了3T3-L1脂肪細胞中的APT1或采用APT1抑制劑處理，發(fā)現(xiàn)APT1的敲除或抑制均可阻斷油酸誘導的CD36內(nèi)化和去棕櫚酰化（圖2）。

圖2. CD36的去棕櫚酰化是脂肪酸內(nèi)吞所必需的

 

那么是什么導致了CD36的去棕櫚�；�。研究人員猜想，DHHC5可能被滅活，因為DHHC的自身棕櫚酰化是催化底物棕櫚�；�的第一步。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，在油酸處理5分鐘后，DHHC5上Tyr91位點的磷酸化顯著增加，而30分鐘后降至基底水平。他們還證實，DHHC5的動態(tài)失活是CD36內(nèi)化所必需的。

 

于是，下一個目標是鑒定將DHHC5磷酸化的激酶。他們敲除了3T3-L1脂肪細胞中豐度相對較高的四個Src家族激酶（SFK），發(fā)現(xiàn)LYN的敲除可抑制油酸誘導的DHHC5磷酸化。利用兩個shRNA敲除LYN后，油酸誘導的CD36內(nèi)化以及CD36和DHHC5的去棕櫚�；�被阻斷，證實LYN可在Tyr91位點將DHHC5磷酸化。

 

不過，CD36的去棕櫚酰化如何啟動內(nèi)吞作用呢？研究人員首先研究了dynamin、VAV和JNK的招募，這些蛋白曾被報道參與了CD36的內(nèi)吞作用。利用各個蛋白的抑制劑處理后，他們發(fā)現(xiàn)所有抑制劑均能阻斷油酸誘導的CD36內(nèi)吞作用。同時，油酸處理導致VAV和JNK的磷酸化增加，表明CD36的去棕櫚�；�需要招募這些蛋白。

 

通過進一步的研究，他們發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶SYK在油酸處理后被激活，并招募到質(zhì)膜上。SYK抑制劑（piceatannol）的處理在很大程度上消除了油酸誘導的VAV和JNK磷酸化以及CD36的內(nèi)化，但并不影響CD36去棕櫚�；�，表明SYK激活是CD36去棕櫚�；�的下游事件。SYK將VAV和JNK磷酸化，從而啟動CD36介導的內(nèi)吞作用。

 

內(nèi)吞作用的阻斷可抑制CD36的生理功能

最后，研究人員評估了CD36介導的脂肪酸內(nèi)吞有何生理意義。由于脂肪酸吸收的主要功能是將脂肪酸儲存在脂肪細胞的脂滴中，因此他們探討了內(nèi)吞作用的阻斷對脂滴生長有何影響。與野生型脂肪細胞不同，Cd36−/−脂肪細胞經(jīng)過油滴處理后幾乎沒有明顯的脂滴生長，表明內(nèi)吞作用的阻斷可以消除CD36依賴性的脂滴生長。此外，通過靶向LYN或SYK來阻斷內(nèi)吞作用，也能夠抑制飲食誘導肥胖小鼠的體重增加。

 

最后，研究人員評估了CD36介導的脂肪酸內(nèi)吞有何生理意義。由于脂肪酸吸收的主要功能是將脂肪酸儲存在脂肪細胞的脂滴中，因此他們探討了內(nèi)吞作用的阻斷對脂滴生長有何影響。與野生型脂肪細胞不同，Cd36−/−脂肪細胞經(jīng)過油滴處理后幾乎沒有明顯的脂滴生長，表明內(nèi)吞作用的阻斷可以消除CD36依賴性的脂滴生長。此外，通過靶向LYN或SYK來阻斷內(nèi)吞作用，也能夠抑制飲食誘導肥胖小鼠的體重增加。

圖3. CD36介導的caveolar內(nèi)吞促進脂肪酸吸收的工作模型

 

原文檢索：

Hao, J., Wang, J., Guo, H. et al. CD36 facilitates fatty acid uptake by dynamic palmitoylation-regulated endocytosis. Nat Commun 11, 4765 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-18565-8.

 

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