LncRNA發(fā)生m5C異常修飾或成肝癌診斷新靶點(diǎn)的應(yīng)用

前言：
近年來(lái)，異常RNA修飾與腫瘤發(fā)生的關(guān)系引起了廣泛關(guān)注。作為一種廣泛存在的修飾，DNA和RNA中的5-甲基胞嘧啶(m5C)已被發(fā)現(xiàn)數(shù)十年。DNA m5C修飾在腫瘤發(fā)生中的作用已被廣泛研究。然而，關(guān)于RNA m5C修飾在腫瘤發(fā)生中的作用知之甚少。NSUN2是哺乳動(dòng)物中主要的m5C修飾甲基轉(zhuǎn)移酶之一，在RNA代謝過(guò)程中起重要作用。近期，云序客戶在一項(xiàng)研究中通過(guò)云序提供的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)合m5C-Bis-Seq測(cè)序的方法，首次發(fā)現(xiàn)H19 LncRNA是NSUN2 RNA甲基修飾酶的特異靶點(diǎn)。該結(jié)果幫助我們更深的理解RNA生物學(xué)和人類(lèi)疾病中m5C RNA甲基化的功能，同時(shí)可為肝癌的診斷和治療提供潛在的靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。 發(fā)表期刊：Oncogene
影響因子：8
研究方法：m5C-Bis-Seq測(cè)序，全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，RNA pull down+質(zhì)譜分析，蛋白免疫沉淀
文章鏈接：Aberrant NSUN2-mediated m5C modification of H19 LncRNA is associated with poor differentiation of hepatocellular carcinoma

研究?jī)?nèi)容：
（1）NSUN2缺失細(xì)胞構(gòu)建和NSUN2功能研究
為了探討NSUN2在肝細(xì)胞癌（HepG2）中的功能作用，首先通過(guò)基因敲除構(gòu)建NSUN2缺失的HepG2細(xì)胞，以此與野生肝癌細(xì)胞對(duì)比。通過(guò)RT-qPCR和western blot等反應(yīng)評(píng)估得出，細(xì)胞超過(guò)90%的NSUN2的基因表達(dá)受到抑制，證明缺失株構(gòu)建成功。
體外生長(zhǎng)試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)NSUN2基因缺失細(xì)胞生存力和細(xì)胞克隆能力顯著降低；用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布發(fā)現(xiàn)與野生型細(xì)胞相比，NSUN2缺陷型肝癌細(xì)胞少量處在G1和S期，更多處于G2和M期，說(shuō)明缺失NSUN2基因HepG2細(xì)胞增殖與分裂受到抑制。 進(jìn)一步采用傷口愈合試驗(yàn)和Trans-well侵襲試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NSUS 2基因缺失導(dǎo)致細(xì)胞遷移和增殖能力受限。用肝癌細(xì)胞接種裸鼠也發(fā)現(xiàn)，接種NSUS 2缺失細(xì)胞形成的腫瘤明顯小于接種野生型肝癌細(xì)胞形成的腫瘤。這些結(jié)果與體外結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了NSUN2在肝癌細(xì)胞的致瘤性中起重要作用。 （2）NSUN2基因缺失細(xì)胞RNA表達(dá)和m5C修飾表達(dá)譜
基于NSUN2缺失后細(xì)胞表型的改變，為進(jìn)一步探索其分子層面的變化，對(duì)野生型HepG2和NSUN2缺陷型HepG2進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和m5C-Bis-Seq測(cè)序。RNA-Seq測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)2681個(gè)差異表達(dá)基因，富集途徑大多數(shù)與致癌作用有關(guān)，包括癌癥過(guò)程、Rap1信號(hào)途徑、PI3K-Akt信號(hào)途徑、癌癥中的蛋白聚糖和TGF-β信號(hào)途徑(圖3c)。m5C-Bis-Seq總共鑒定出1208個(gè)基因中11788個(gè)m5C候選位點(diǎn)在HepG2和NSUN2缺失細(xì)胞之間有差異甲基化。KEGG富集分析顯示這些DMGs在20種途徑中富集，包括剪接體、癌癥中的蛋白聚糖、細(xì)胞周期、雌激素信號(hào)通路等（圖3e）。RNA-Seq與m5C-Bis-Seq比較分析后得出，NSUN2缺失，導(dǎo)致包括H19 LncRNA在內(nèi)的52個(gè)lncRNA在m5C甲基化和lncRNA表達(dá)方面都有顯著變化。
（3）H19 LncRNA是NSUN2的底物
NSUN2缺失后，RT-qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)H19的表達(dá)下調(diào)了至少80%，H19特異性引物的Bisulfite-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)H19 RNA C986位點(diǎn)甲基化完全喪失。而NSUN2的重新表達(dá)在一定程度上恢復(fù)了H19 LncRNA在NSUN2缺陷型肝癌細(xì)胞中的表達(dá)和甲基化。 （4）m5C修飾影響H19 RNA的半衰期與穩(wěn)定性
為進(jìn)一步驗(yàn)證NSUN2介導(dǎo)H19 LncRNA甲基化是否會(huì)影響H19 LncRNA表達(dá)水平。研究者使肝癌細(xì)胞接受ActD 處理，然后進(jìn)行RT-qPCR分析H19 RNA半衰期。如圖5a所示，H19 RNA的半衰期在NSUN2缺失后顯著縮短。此外，在NSUN2缺陷的HepG2細(xì)胞中，NSUN2的重新表達(dá)在一定程度上恢復(fù)了H19 RNA的半衰期(圖5b)。與此同時(shí)陰性對(duì)照顯示NSUN2的缺失或重新表達(dá)不影響ACT-B基因的半衰期。
此外，m5C位點(diǎn)在調(diào)節(jié)H19穩(wěn)定性是使用熒光素酶報(bào)告分析來(lái)驗(yàn)證的，該分析通過(guò)構(gòu)建含有野生型H19基因片段（H19-Wt）和具有突變m5C位點(diǎn)H19基因片段（H19Mut）的細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的。不出所料，m5C位點(diǎn)突變顯著抑制正常肝癌細(xì)胞的熒光素酶活性，但不抑制NSUN2缺陷肝癌細(xì)胞的熒光素酶活性(圖5c)。H19-Wt的熒光素酶活性在正常HepG2細(xì)胞中顯著高于NSUN2缺陷型HepG2細(xì)胞。因此，這些結(jié)果表明NSUN2介導(dǎo)的RNA甲基化可能使H19 LncRNA穩(wěn)定。

（5）H19表達(dá)和m5C修飾與HCC分化有關(guān)
接下來(lái)，作者測(cè)定了55名HCC患者的HCC組織及其癌旁正常組織中H19 RNA的表達(dá)和甲基化水平。與癌旁組織相比，H19在HCC組織中的表達(dá)顯著增加，H19 C986位點(diǎn)的甲基化水平明顯升高，此外，H19 RNA水平與其在這些組織中的RNA甲基化水平顯著相關(guān)(p< 0.01，r= 0.511)(圖5f)。
然而在HCC組織和癌旁組織之間，NSUN2 mRNA水平?jīng)]有顯著變化組織(圖5g)。當(dāng)與H19 C986甲基化水平差異超過(guò)10%的組織進(jìn)行比較時(shí)，HCC組織中的NSUN2 mRNA水平顯著高于癌旁組織(圖5h)。表明NSUN2介導(dǎo)的H19 LncRNA的m5C異常修飾與腫瘤分化程度相關(guān)。綜上所述，我們的發(fā)現(xiàn)表明H19的RNA甲基化水平在HCC增加，并與其表達(dá)呈正相關(guān)，這與惡性HCC病顯著相關(guān)。 （6）NSUN2介導(dǎo)m5C修飾的H19 LncRNA與癌蛋白G3BP1相互作用
XIST和HOTAIR LncRNAs m5C修飾被證明能調(diào)節(jié)它們與PRC2的相互作用。
因此，作者猜測(cè)m5C修飾的H19 LncRNA可能調(diào)節(jié)其與其他蛋白質(zhì)的相互作用。通過(guò)使用RNA pulldown-MS技術(shù)（云序可提供），分離鑒定到與H19 LncRNA結(jié)合蛋白G3BP1。由H19 RNA探針下拉的G3BP1在野生型HepG2細(xì)胞中可檢測(cè)到，但在NSUS 2缺陷型HepG2細(xì)胞中檢測(cè)不到，同時(shí)，在野生型HepG2細(xì)胞和NSUS 2缺陷型HepG2細(xì)胞之間的G3BP1蛋白水平?jīng)]有顯著變化(圖6b)，表明H19 RNA和G3BP1蛋白之間的相互作用可能受到NSUS 2的影響。使用G3BP1抗體的RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀RIP-PCR（云序可提供）證實(shí)了這一概念(圖6c)。G3BP1在野生型HepG2細(xì)胞中特異性結(jié)合H19 LncRNA，而在NSUS 2缺陷型HepG2細(xì)胞中不結(jié)合，這一事實(shí)表明H19 LncRNA與G3BP1蛋白的相互作用可能依賴(lài)于NSUS 2介導(dǎo)的RNA甲基化。用純化的重組人G3BP1蛋白和H19 RNA探針進(jìn)行了進(jìn)一步的rEMSA實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示G3BP1重組蛋白優(yōu)先結(jié)合m5C修飾的寡核苷酸(圖6d)，表明G3BP1蛋白和H19 RNA結(jié)合受m5C修飾調(diào)控。 點(diǎn)評(píng)：
文章通過(guò)m5C-Bis-Seq結(jié)合全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（云序提供），通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析篩選到差異的m5C修飾的差異RNA，該方法的優(yōu)點(diǎn)是兩個(gè)測(cè)序結(jié)果取交集縮小差異范圍，明確科研檢測(cè)目標(biāo)。另外m5C-MeRIP結(jié)合RNA pull down實(shí)驗(yàn)（云序可提供），正反向驗(yàn)證與RNA特異性結(jié)合的蛋白，對(duì)深度挖掘不同分子的RNA修飾機(jī)制提供可靠的依據(jù)。

云序m5C RNA修飾課題技術(shù)服務(wù)五大模塊:
m5C RNA修飾測(cè)序
MeRIP-seq
通過(guò)使用m5C抗體富集高甲基化的RNA片段，然后結(jié)合高通量測(cè)序，在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)研究發(fā)生甲基化的RNA區(qū)域
Bis-seq
通過(guò)重亞硫酸鹽處理，使未甲基化的C發(fā)生轉(zhuǎn)變，再結(jié)合高通量測(cè)序，可得到單堿基分辨率的m5C修飾位點(diǎn)
m5C RNA修飾靶基因驗(yàn)證
MeRIP-qPCR
云序提供m5C的MeRIP-qPCR服務(wù)，可針對(duì)mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類(lèi)型的RNA分子進(jìn)行檢測(cè)，低通量驗(yàn)證m5C修飾靶基因表達(dá)水平。
機(jī)制互作研究
RIP-seq/qPCR
篩選或驗(yàn)證m5C修飾直接靶點(diǎn)，研究m5C修飾靶基因的調(diào)控機(jī)制。
RNA pull down -MS/WB
篩選或驗(yàn)證目標(biāo)RNA互作基因或蛋白，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。
雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)
驗(yàn)證兩基因互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。
RNA修飾上游酶的篩選
RNA修飾相關(guān)酶PCR芯片
尋找上游直接調(diào)控m5C甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶。
檢測(cè)整體m5C RNA修飾水平
LC-MS/MS檢測(cè)整體RNA修飾水平
精準(zhǔn)高效，可以實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)，9類(lèi)修飾水平檢測(cè)，一步到位。
 

上海云序生物科技有限公司
Shanghai Cloud-seq Biotech Co., Ltd.
地址：上海市松江區(qū)莘磚公路 518 號(hào) 20 號(hào)樓 3 樓
電話：021-64878766
傳真：021-64878766
網(wǎng)址：www.cloud-seq.com.cn
郵箱：market@cloud-seq.com.cn