走近阿斯利康PD-1/CTLA-4雙抗研發(fā)之路

英國制藥巨頭阿斯利康（AstraZeneca）公司在genOway的PD-1/CTLA-4雙免疫檢查點人源化小鼠（賽業(yè)生物已與genOway達成戰(zhàn)略合作伙伴關(guān)系并引進該小鼠）上測試了一款新型的同時靶向PD-1和CTLA-4的單價雙特異性抗體MEDI5752，研究結(jié)果發(fā)表在了Cancer Discovery上。

 

背景

免疫檢查點療法是近來腫瘤治療的熱門領(lǐng)域，其中，靶向PD-1、PD-L1和CTLA-4的抑制劑都已獲批上市，并取得了顯著成果。此外，PD-1和CTLA-4抑制劑的聯(lián)用也在包括黑色素瘤、腎癌、非小細胞肺癌在內(nèi)的多種腫瘤中表現(xiàn)出了顯著增強的抗腫瘤效果。但其中，CTLA-4抑制劑的免疫相關(guān)不良事件（(immune-relatedadverse events，irAEs）也一直是個令人頭疼的問題，包括常見的胃腸道毒性、皮膚毒性和肝臟毒性等。為了解決這個問題，AstraZeneca公司研發(fā)了一款同時靶向PD-1和CTLA-4的單價雙特異性抗體MEDI5752。MEDI5752是一種能優(yōu)先抑制PD-1+ T細胞上CTLA-4的新型免疫抑制劑。

 

與傳統(tǒng)的PD-1/CTLA-4雙抗不同，MEDI5752能引發(fā)對PD-1的快速內(nèi)化和降解，并能優(yōu)先定位和聚積在腫瘤部位。MEDI5752目前正處于phase I 階段(NCT03530397)，并在兩名晚期實體瘤患者中觀測到了部分緩解（partial response, PR）。

 

此外，值得一提的是，AstraZeneca有一款最早由輝瑞 （Pfizer）公司研發(fā)是anti-CTLA-4全人源化單克隆抗體Tremelimumab。但由于Tremelimumab在臨床試驗中一直表現(xiàn)不佳，直至目前為止，還沒有獲批治療任何癌癥。AstraZeneca也在嘗試將Tremelimumab與其他免疫檢查點抑制劑藥物聯(lián)用，例如，Tremelimumab與Imfinzi（anti-PD-L1）聯(lián)用來治療非小細胞肺癌（III期NEPTUNE試驗失�。�、晚期膀胱癌（III期DANUBE試驗失�。�、肝細胞癌（III期HIMALAYA試驗進行中）等癌癥。AstraZeneca將Tremelimumab和一個anti-PD-1 mAb進行組合與改造，構(gòu)建了MEDI5752。

 

CTLA-4在多種實體瘤TILs中的PD-1+ T細胞上表達富集

研究人員分析了來自4種腫瘤的44個腫瘤樣本：結(jié)直腸癌（CRC）、非小細胞肺癌（NSCLC）、腎細胞癌（RCC）和黑色素瘤（Melanoma），發(fā)現(xiàn)在所有類型的腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)PD-1+ CTLA-4+ 的CD4+ 和CD8+ T細胞，并且CTLA-4的表達在PD-1+ T細胞上富集。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，腫瘤反應(yīng)性CD8+ T細胞的標(biāo)志物CD39在PD-1+ CTLA-4+ 腫瘤浸潤性淋巴細胞 (Tumor Infiltrating Lymphocytes, TILs)上表達富集。在隨后對183例頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN），NSCLC和尿路上皮細胞癌（UCC）樣本進行的影像融合（co-registration）分析顯示，80% SCCHN、84% 鱗狀細胞NSCLC（NSCLC-Sq）、89%腺癌NSCLC（NSCLC-Ad）和 90% 尿路上皮癌（UCC）中都存在PD-1+ CTLA-4+ TILs。

 

MEDI575的結(jié)構(gòu)設(shè)計與特征

AstraZeneca將anti-CTLA-4的Tremelimumab和一個anti-PD-1 mAb進行組合，構(gòu)成了MEDI5752的基本結(jié)構(gòu)。MEDI5752中人gamma-1重鏈恒定區(qū)也進行了改造（L234F、L235E和P331S）以降低Fc介導(dǎo)的免疫效應(yīng)功能。此外，與親本抗體一致，MEDI5752只對小鼠PD-1有低親和力，而和小鼠CTLA-4無交叉反應(yīng)。

圖1. MEDI575的結(jié)構(gòu)示意圖[1]

 

效價對PD-1的抑制作用影響很小，而對CTLA-4影響較大

研究人員使用了雙細胞熒光素酶報告實驗（two-cell luciferase reporter assay）和PBMC實驗來研究抗體效價（valence）對PD-1和CTLA-4抑制作用的影響。雙細胞熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，與二價anti-PD-1 mAb相比，單價anti-PD-1抗體MEDI5752或mvPD-1的半最大效應(yīng)濃度（EC50）分別升高了3.5倍和3.8倍（圖2A-B）；與二價anti-CTLA-4 mAb相比，單價anti-CTLA-4抗體MEDI5752或mvCTLA-4的EC50則分別升高了14.9倍and 13.3倍（圖2C-D）。

 

在PBMC實驗中，研究人員也觀察到了類似的現(xiàn)象。mvPD-1誘導(dǎo)PBMC增加2倍IL2分泌量的最低有效濃度（MEC）只比anti-PD-1 mAb高1.14倍；而mvCTLA-4的MEC則比anti-CTLA-4 mAb高8.1倍。這些結(jié)果說明valence對PD-1的抑制作用影響很小，而對CTLA-4的抑制作用影響較大，因此，MEDI5752與CTLA-4的結(jié)合能力在PD-1− T細胞上可能會顯著下降。

圖2. 單價（Monovalent）降低了MEDI5752對CTLA-4的效力，但對PD-1的抑制作用影響很小[1]

 

MEDI5752能優(yōu)先抑制PD-1+ 細胞上的CTLA-4

在靶向兩個不同的細胞表面受體的雙抗中，雙抗會傾向優(yōu)先與表達密度高的受體結(jié)合。因此，雙抗與表達密度高的受體的結(jié)合率將只取決于對應(yīng)單價臂對該受體的內(nèi)在親和力，而第二個單價臂與表達密度低的受體的結(jié)合則會被限制在一個相當(dāng)于抗體長度的半徑范圍中。在這個范圍里，第二個單價臂對表達密度低的受體的結(jié)合力明顯增強，研究人員將這個現(xiàn)象稱為“cooperative binding”（圖3A）。已知在PD-1+ CTLA-4+ 雙陽性T細胞中，PD-1在細胞膜上的表達密度比CTLA-4高，因此，MEDI5752會優(yōu)先與PD-1結(jié)合。并且，與只表達CTLA-4的PD-1- CTLA-4+ CHO細胞相比，MEDI5752會優(yōu)先靶向和飽和PD-1+ CTLA-4+ CHO細胞上的CTLA-4（圖3B）。

 

為了探究“cooperative binding”的效應(yīng)，研究人員在活化的人PBMC中加入（block）或不加入（no block）飽和濃度的PD-1抗體進行處理。在block組，MEDI5752只會與CTLA4結(jié)合；在no block組，MEDI5752能發(fā)揮“cooperative binding”效應(yīng)。實驗結(jié)果顯示，“cooperative binding”效應(yīng)顯著降低了誘導(dǎo)PBMC增加3倍IL2分泌量所需的MEDI5752濃度（93.55倍） (圖3C)。這些結(jié)果說明MEDI5752 能優(yōu)先抑制PD-1+細胞上的CTLA-4。

圖3. 與PD-1- CTLA-4+ 單陽性細胞相比，MEDI575優(yōu)先與PD-1+ CTLA-4+ 雙陽性細胞上的CTLA-4結(jié)合[1]

 

MEDI5752介導(dǎo)了PD-1的內(nèi)化和降解

有報道顯示，細胞膜表面80%的CTLA-4會在5分鐘內(nèi)被快速內(nèi)化（internalization），因此在任意時間點，細胞膜表面都只會有少量的CTLA-4存在。研究人員探究了MEDI575及其親本抗體在PD-1+ CTLA-4+ CHO細胞、人原代CD4+ 和CD8+ T細胞中的內(nèi)化能力。結(jié)果顯示MEDI5752和只靶向CTLA-4的抗體（anti-CTLA4 mAb和mvCTLA4）都能被快速內(nèi)化，而只靶向PD-1的抗體（anti-PD-1 mAb和mvPD-1）的內(nèi)化程度非常低（圖4A）。

 

為探究內(nèi)化后PD-1和CTLA4的去向，研究人員使用了帶有熒光標(biāo)記的PD-1+ SNAP-tag/CTLA4+ CLIP-tag雙陽性CHO細胞來進行追蹤。實驗結(jié)果顯示，只有同時靶向PD-1和CTLA-4的MEDI575能顯著增強對細胞膜表面PD-1的降解；此外，與加入Buffer的空白對照組對比，加入靶向PD-1或CTLA-4抗體并沒有顯著改變CTLA4的內(nèi)化（圖4B）。這些結(jié)果說明MEDI5752通過與CTLA-4結(jié)合，介導(dǎo)了PD-1的內(nèi)化和降解。

圖4. MEDI575介導(dǎo)了PD-1的內(nèi)化和降解[1]

 

與單抗組合相比，MEDI5752優(yōu)先靶向雙陽性細胞上的CTLA-4

與單抗組合（anti-CTLA4 mAb和anti–PD-1 mAb）相比，MEDI5752能以低10倍和250倍的濃度分別使PD-1+ CTLA-4+（10:1）CHO細胞和PD-1+ CTLA-4+（40:1）CHO細胞上的CTLA-4飽和（圖5A-B）。此外，MEDI5752飽和PD-1的能力與單抗組合相比沒有明顯區(qū)別（圖5B）。接下來，研究人員再次在活化PBMC上探究了MEDI5752 的“cooperative binding”效應(yīng)。實驗結(jié)果顯示，與單抗組合（anti-PD-1 mAb/anti-CTLA4 mAb 或anti-PD-1 mAb/mvCTLA4 mAb）相比，MEDI5752 的“cooperative binding”效應(yīng)顯著降低了誘導(dǎo)PBMC增加3倍IL2分泌量所需的MEDI5752濃度（42.33倍和96.35倍）（圖5C-D）。這些結(jié)果說明與單抗組合相比，MEDI5752有更強的功效。

 

由于CTLA-4能通過在Treg上的表達來內(nèi)在地和外在地調(diào)節(jié)T細胞活化，研究人員將原代Treg與同種異體（allogeneic）的CD3+ T細胞，以及清除了CD3+ 細胞的PBMC共培養(yǎng)，來模擬相關(guān)共刺激分子存在時，淋巴細胞的免疫反應(yīng)。實驗結(jié)果顯示，單抗組合能克服Treg介導(dǎo)的對Teff的抑制作用，且與單抗組合相比，在Treg:Teff比例為1:4和1:8時，MEDI5752能使IFNγ的分泌量顯著增加（圖5E-G）。這些結(jié)果說明與單抗組合相比，MEDI5752在T細胞活化和克服Treg介導(dǎo)的抑制作用時有更高的活性。

圖5. 與單抗組合相比，MEDI5752優(yōu)先靶向雙陽性細胞上的CTLA-4[1]

 

MEDI5752在體內(nèi)能優(yōu)先定位于腫瘤部位并抑制腫瘤生長

由于MEDI5752與小鼠PD-1和CTLA-4缺乏交叉反應(yīng)，研究人員使用了一款表達人PD-1和CTLA-4蛋白（C57BL/6N-Pdcd1tm1(huPDCD1-ICP11)GenoCtla4tm1(huCTLA4-ICP13)Geno）的轉(zhuǎn)基因小鼠來進行體內(nèi)實驗。賽業(yè)已引進該PD-1/CTLA-4雙免疫檢查點人源化小鼠。實驗結(jié)果顯示，在攜帶小鼠纖維肉瘤MCA205的hPD-1/hCTLA-4小鼠中，與傳統(tǒng)的anti-CTLA4和isotype mAb相比，MEDI5752顯著聚積在腫瘤部位；MEDI5752與傳統(tǒng)的anti-PD-1 mAb在腫瘤部位的聚積程度相似（圖6A-D）。這些結(jié)果說明MEDI5752在腫瘤部位的聚積依賴于與腫瘤表面PD-1的結(jié)合。同時，這也說明對比anti-CTLA4 mAb，MEDI5752能更有效地阻斷腫瘤微環(huán)境中的CTLA-4。

 

在MCA205荷瘤模型中，MEDI5752也顯示出了強烈的，劑量依賴性的抗腫瘤活性：當(dāng)注射劑量為10 mg/kg時，MCA205在超過60%的小鼠中完全清除了腫瘤（圖6E）。此外，與anti-PD-1和anti-CTLA4 mAb對比，單抗組合并沒有顯著提高荷瘤小鼠生存率，而MEDI5752功效顯著（圖6F）。而且，將人類病毒特異性T細胞注射到攜帶人病毒肽轉(zhuǎn)導(dǎo)的OE21腫瘤的NSG小鼠中后，MEDI5752顯著抑制了腫瘤生長（圖6G）。這些結(jié)果說明與anti-CTLA4 mAb相比，MEDI5752在體內(nèi)能優(yōu)先定位于腫瘤部位;而與單抗組合相比，MEDI5752有更強的抗腫瘤活性。

圖6. MEDI5752在體內(nèi)能優(yōu)先定位于腫瘤部位并抑制腫瘤生長[1]

 

MEDI5752在晚期實體瘤中被證明有抗腫瘤活性

目前，MEDI5752正在進行一項針對晚期實體瘤的評估(NCT03530397)，這也是MEDI5752在人體內(nèi)的首次試驗。MEDI5752在兩名患者體內(nèi)實現(xiàn)了部分緩解。其中，一名已經(jīng)歷五次化療失敗的61歲胃腺癌患者的腫瘤縮小了60％（圖7A）；另一名從未經(jīng)過治療的51歲腎透明細胞癌患者的腫瘤縮小了68％（圖7B）。目前，兩名患者的無進展（progression-free）生存期已分別有80周和24周，且毒性可控。

圖7. MEDI5752在晚期實體瘤中有抗腫瘤活性[1]

 

總結(jié)

AstraZeneca這款同時靶向PD-1和CTLA-4的單價雙抗MEDI5752在體外和體內(nèi)實驗中均顯示出了顯著的抗腫瘤活性。MEDI5752利用“cooperative binding”，在靶向PD-1+ T細胞的同時，提高了anti-CTLA-4單臂對CTLA-4的結(jié)合力，且能優(yōu)先抑制PD-1+細胞上的CTLA-4。此外，MEDI5752融合了anti-CTLA-4和anti-PD-1的優(yōu)勢，能引發(fā)對PD-1的快速內(nèi)化，并能優(yōu)先定位在腫瘤部位。這些都顯示出了PD-1/CTLA-4雙抗的獨特優(yōu)勢。

 

目前，多家公司在PD-1/CTLA-4雙抗上也均有布局，產(chǎn)品包括中山康方（ Akesobio ）已進入phase Ib/II 的AK104、康寧杰瑞（Alphamab）已進入phase II的KN046、齊魯制藥（Qilu Pharmaceutical）已進入phase I的QL1706等。

 

賽業(yè)生物模式動物創(chuàng)新藥物研發(fā)平臺還可以根據(jù)您的需求提供各種有效的腫瘤研究模型，如傳統(tǒng)免疫缺陷鼠裸鼠、NOD scid、重度免疫缺陷鼠C-NKG和BRGSF、免疫檢查點人源化小鼠、腫瘤細胞系移植模型、人源腫瘤組織異種移植模型（CDX）、基因修飾模型及表型分析服務(wù)等。我們可以構(gòu)建各類皮下、原位或者轉(zhuǎn)移瘤模型，并針對相應(yīng)的模型提供高度定制化的體內(nèi)藥效學(xué)服務(wù)，以滿足您的需求。如有需要，歡迎聯(lián)系我們~

 

PD-1/CTLA-4雙人源化小鼠助力腫瘤研究

品系背景： C57BL/6N

品系構(gòu)建策略：

PD-1/CTLA-4雙免疫檢查點人源化小鼠模型（hPD-1/hCTLA-4）由hPD-1小鼠和hCTLA-4小鼠雜交得到。

 

品系說明：

■ hPD-1和hCTLA-4在小鼠體內(nèi)具有正常的生理表達和調(diào)節(jié)模式。

■ PD1和CTLA-4胞外域人源化，利于hPD-1和hCTLA-4靶向藥物的識別。

■ 保留小鼠PD-1和CTLA-4胞內(nèi)域，保證正常的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

■ 小鼠靶基因不表達，避免交叉反應(yīng)。

小鼠的免疫系統(tǒng)功能健全。

 

研究應(yīng)用：

本模型可用于評估hPD-1和/或hCTLA-4靶向藥物在免疫健全小鼠體內(nèi)的藥效及安全性：

可以與人源腫瘤細胞系 MC38-hPD-L1聯(lián)用，構(gòu)建同源腫瘤模型，以測試靶向人PD-1和人PD-L1的聯(lián)合療法的療效。

 

模型驗證：

PD-1和CTLA-4表達檢測

圖1. hPD-1和hCTLA-4在hPD-1/hCTLA-4小鼠中的表達模式與mPD-1和mCTLA-4在野生型小鼠中的表達模式一致。

用αCD3/αCD29抗體激活從野生型小鼠和hPD-1/hCTLA-4小鼠中分離的脾細胞。在hPD-1/hCTLA-4小鼠中，傳統(tǒng)CD4+ T細胞表達hPD-1和hCTLA-4；在野生型小鼠中，傳統(tǒng)CD4+ T細胞表達mPD-1和mCTLA-4。

 

圖2. hPD-1和hCTLA-4在腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）中的表達情況。

在hPD-1/hCTLA-4小鼠和野生型小鼠體內(nèi)接種MCA205小鼠纖維肉瘤細胞，并分析TILs上鼠源和人源PD-1以及CTLA-4在的表達情況。