Nlrp3基因敲除小鼠與炎癥性疾病

賽業(yè)生物《每周一鼠》欄目，每周五更新，為大家講解一個小鼠模型的故事，希望對大家了解不同的疾病小鼠模型有所幫助。今天和大家見面的是Nlrp3基因編輯小鼠。

背景介紹
Nlrp3基因編碼一個pyrin樣蛋白，蛋白包含一個pyrin結構域，一個核苷酸結合位點(NBS)結構域和一個富亮氨酸重復序列(LRR)基序。該蛋白與凋亡相關的斑點樣蛋白PYCARD/ASC相互作用，PYCARD/ASC包含一個caspase招募域，是NLRP3炎癥小體復合體的成員。該復合物作為NF-kappaB信號的上游激活因子，并在炎癥、免疫反應和細胞凋亡的調節(jié)中發(fā)揮作用。
 

圖1. 炎癥小體的分子機制示意圖[1]

 

IL-1β，也稱為內源性熱原，是一種高度炎癥細胞因子，其產生受到至少三個不同步驟的嚴格控制。第一步涉及pro-IL-1β蛋白（p35）的產生；隨后裂解pro-IL-1β前體以產生活性 IL-1β 蛋白 (p17)，最后將 IL-1β 釋放到細胞外環(huán)境中。中間步驟，即 pro-IL-1β 的加工，涉及激活 caspase-1 激活復合物，其最佳特征是炎癥小體。NLRP3 炎癥小體將無活性的 pro-caspase-1 加工成有活性的 Caspase-1，它將pro-IL-1β裂解為成熟的 IL-1β，導致炎癥和細胞過早死亡。

編碼 Cryopyrin 的基因NLRP3的顯性遺傳突變被證明是導致一系列炎癥疾病的原因，包括家族性感冒自身炎癥綜合征 (FCAS)、Muckle -Wells 綜合征 (MWS) 和新生兒多系統(tǒng)炎癥性疾病 (NOMID) ，現(xiàn)在統(tǒng)稱為冷熱蛋白相關周期性綜合征 (CAPS)。

Nlrp3基因編輯小鼠表型
1. 點突變模型
丙氨酸 352 到纈氨酸 (A352V) 和亮氨酸 353 到脯氨酸 (L353P) 的突變分別與經(jīng)典 MWS 和 FCAS 患者密切相關，而在重疊綜合征患者中則不太相關。通過ES打靶技術生成兩個點突變小鼠模型：Nlrp3 A350V 和Nlrp3 L351P。因內含子中Neo的存在，阻斷了基因的正常表達，通過交配不同啟動子下表達Cre重組酶的小鼠介導Neo在不同部位刪除并表達突變基因。
 

圖2. Nlrp3 點突變小鼠打靶策略[3]

Nlrp3 A350V/+ / CreZ（胚胎期刪除Neo并表達突變基因）幼崽在出生后 1-2 天或之前表現(xiàn)出炎癥表型，在第 4 天出現(xiàn)皮膚膿腫，并出現(xiàn)鱗屑狀紅斑（圖3A）。此外，這些小鼠在第 4 天表現(xiàn)出明顯的生長延遲，缺乏色素沉著和毛發(fā)生長。Nlrp3 A350V/+ / CreL（骨髓細胞系刪除Neo并表達突變基因)幼崽表現(xiàn)出相似的表型，但具有不同的死亡率動力學，因此這些小鼠中有 70% 存活到第 7-9 天，然后以增加的速度死亡。
 

圖3. Nlrp3 點突變小鼠相關表型數(shù)據(jù)[3]

雖然與 MWS 患者中觀察到的蕁麻疹樣病變不同，但在表達 A350V 的幼崽中觀察到的皮膚紅斑、膿腫和鱗屑表明存在潛在炎癥。突變小鼠總體白細胞計數(shù)僅輕度升高，但中性粒細胞和血小板增多是明顯的。在 CAPS 患者中一致描述了類似的血液學和皮膚檢查結果。來自Nlrp3 A350V/+ / CreL幼崽的發(fā)炎皮膚切片進行了 IL-1β 和 IL-6 的免疫組織化學。兩種細胞因子（主要在真皮中的 IL-1β 和表皮中的 IL-6）的表達增加，與來自 CAPS 患者的皮膚活檢一致，并暗示這些細胞因子在皮膚病理學中的作用。TNFα 沒有顯著差異，這與先前描述的 CAPS 患者一致。
 

圖4. Nlrp3 點突變小鼠血清和皮膚中多種細胞因子上調[3]

2. 敲除小鼠模型

通過ES打靶技術生成Nlrp3 （Cias1)敲除小鼠模型，通過在ATG起始位置處插入EGFP達到敲除的目的：

圖5. Nlrp3基因敲除小鼠打靶策略[5]

野生型、Nlrp3+/-和Nlrp3-/-巨噬細胞產生相當數(shù)量的 pro-IL-1β，然而，與它們的野生型對應物不同，Nlrp3-/-巨噬細胞在 ATP 處理后沒有切割 pro-IL-1β，表明，cryopyrin 對于 ATP 誘導的 caspase-1 激活至關重要；用 LPS或 Pam3CSK4 引發(fā)的野生型巨噬細胞響應尼日利亞菌素或 maitotoxin分泌IL-1β和IL-18，相比之下，Asc-/-和Nlrp3-/-巨噬細胞均未釋放顯著的IL-1β或IL-18。

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參考文獻：

1. Stojanov S, Kastner DL. Familial autoinflammatory diseases: genetics, pathogenesis and treatment. Curr Opin Rheumatol. 2005 Sep;17(5):586-99. doi: 10.1097/bor.0000174210.78449.6b. PMID: 16093838.

2. Sutterwala FS, Ogura Y, Szczepanik M, Lara-Tejero M, Lichtenberger GS, Grant EP, Bertin J, Coyle AJ, Galán JE, Askenase PW, Flavell RA. Critical role for NALP3/CIAS1/Cryopyrin in innate and adaptive immunity through its regulation of caspase-1. Immunity. 2006 Mar;24(3):317-27. doi: 10.1016/j.immuni.2006.02.004. PMID: 16546100.

3. Kuemmerle-Deschner JB, Haug I. Canakinumab in patients with cryopyrin-associated periodic syndrome: an update for clinicians. Ther Adv Musculoskelet Dis. 2013 Dec;5(6):315-29. doi: 10.1177/1759720X13502629. PMID: 24294305; PMCID: PMC3836377.

4. Brydges SD, Mueller JL, McGeough MD, Pena CA, Misaghi A, Gandhi C, Putnam CD, Boyle DL, Firestein GS, Horner AA, Soroosh P, Watford WT, O'Shea JJ, Kastner DL, Hoffman HM. Inflammasome-mediated disease animal models reveal roles for innate but not adaptive immunity. Immunity. 2009 Jun 19;30(6):875-87. doi: 10.1016/j.immuni.2009.05.005. Epub 2009 Jun 4. PMID: 19501000; PMCID: PMC2759865.

5. Mariathasan S, Weiss DS, Newton K, McBride J, O'Rourke K, Roose-Girma M, Lee WP, Weinrauch Y, Monack DM, Dixit VM. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 2006 Mar 9;440(7081):228-32. doi: 10.1038/nature04515. Epub 2006 Jan 11. PMID: 16407890.