論文解讀：線性泛素化調控血管生成的新機制

軍事科學院軍事醫(yī)學研究院生命組學研究所的張令強團隊和賀福初團隊聯合哈佛大學醫(yī)學院的魏文毅團隊和中科院微生物所的劉翠華團隊近日在Molecular Cell雜志上發(fā)文，解析了線性泛素化調控血管生成的新機制。
 

泛素化通過泛素鏈與底物的結合來控制蛋白質降解和信號轉導，最終影響每一個細胞過程。通過N端甲硫氨酸殘基（M1）連接形成的泛素鏈又稱為線性泛素鏈，在NF-kB介導的炎癥和免疫應答中起著至關重要的作用。

線性泛素鏈組裝復合物（LUBAC）由泛素連接酶HOIP和兩個調節(jié)亞基HOIL-1L和SHARPIN組成，負責在NEMO、RIPK1、RIPK2等底物上形成線性泛素鏈。OTULIN則是一種特異性去除線性泛素鏈的去泛素化酶。OTULIN與LUBAC協同作用，編輯線性泛素鏈，在胚胎發(fā)育、自身免疫和炎性疾病等過程中起作用。然而，線性泛素化調控血管生成的具體機制仍不清楚。

ALK1是線性泛素化修飾的底物
為了確定線性泛素鏈在胚胎發(fā)育中的生理功能，研究人員首先生成了Otulin缺陷型小鼠。他們發(fā)現，OTULIN全敲除和血管內皮細胞敲除小鼠均在胚胎E13.5天死亡，并且存在畸形的血管結構。相比之下，OTULIN心內膜敲除小鼠則正常出生，沒有血管生成缺陷。因此，他們認為內皮細胞（endothelial cells, EC）中的OTULIN是胚胎發(fā)育血管生成所必需的，其缺失導致嚴重的血管生成缺陷，尤其是動靜脈畸形。

在研究背后的機制時，他們發(fā)現E12.5天時Otulin-KO胚胎中Smad1/5的C端磷酸化降低，而Smad2/3和Smad1的MH1-MH2接頭的C端磷酸化沒有改變。這可能解釋了Otulin-null表型。之后他們篩選了Smad1/5的I型受體，發(fā)現只有ALK1被線性泛素鏈特異性修飾。后續(xù)的一系列實驗表明，ALK1是線性泛素化修飾的特異性底物。
 

圖1. 用anti-Flag抗體免疫沉淀細胞裂解液。使用免疫印跡法檢測免疫沉淀物以檢測線性泛素化。NEMO 用作陽性對照。

ALK1的線性泛素化降低下游Smad1/5信號傳導
研究人員發(fā)現，HOIP抑制劑11a限制了ALK1上線性泛素鏈的形成。為了在體內證實這些結果，他們用BMP9（ALK1刺激物）來處理原代HUVEC細胞，并使用11a來抑制線性泛素鏈的形成，發(fā)現Smad1/5磷酸化和下游靶標的表達被抑制劑11a所增強。相反，泛素連接酶HOIP的異位過表達減弱了Smad1/5磷酸化和下游靶標表達。之后，通過突變體構建和結構生物信息學分析，他們證明ALK1的線性泛素化會抑制ALK1的激酶活性，降低ALK1- Smad1/5信號傳導。

既然如此，那么OTULIN是否對ALK1進行去泛素化，繼而促進Smad1/5激活？他們發(fā)現，正如預期的那樣，OTULIN切割了LUBAC催化的ALK1上的線性泛素鏈。體外和體內實驗均表明，OTULIN的缺失促進了ALK1的線性泛素化，并伴隨著Smad1/5磷酸化和下游靶標表達的降低。這些結果表明，OTULIN從ALK1上切割線性泛素鏈以釋放ALK1激酶活性，并促進Smad1/5激活。

接著，為了證實ALK1是線性泛素化的真正生理靶點并導致Otulin-null敲除胚胎致死，研究人員打算在E12.5 Otulin-null胚胎中的ALK1激酶活性被限制之前補償ALK1-Smad1/5信號強度，以挽救Otulin-null胚胎的表型。他們提前在懷孕小鼠腹膜內注射BMP9，發(fā)現Otulin-null胚胎的存活時間延長。為了進一步確認減弱的ALK1激酶活性是否是在E13.5觀察到的胚胎致死的原因，他們還委托賽業(yè)生物構建了EC條件性敲入小鼠ALK1Q200D（小鼠ALK1的Q200D突變導致ALK1組成型激活），發(fā)現這些胚胎的存活時間顯著延長。這些實驗表明，Smad1/5磷酸化的增強是Otulin-null胚胎存活所必需的，而BMP9刺激或ALK1的組成型激活可延長這些胚胎的存活時間。
 

圖2. 通過注射BMP9以及EC條件性敲入ALK1Q200D可以延長Otulin EC-KO胚胎的存活時間。

HOIP抑制劑可挽救患者來源EC的異常表型
之前的研究表明，ALK1中的突變會引起2型遺傳性出血性毛細血管擴張癥（HHT2），這是一種常染色體顯性的血管疾病，患者因動靜脈畸形而在多個部位出現明顯的血管病變。因此，研究人員想了解HHT相關的ALK1突變是否會影響ALK1與HOIP之間的相互作用以及隨后的ALK1線性泛素化。

他們篩選了25例攜帶ALK1突變的HHT患者家系，發(fā)現一對母子攜帶了ALK1 G309S突變。后續(xù)分析表明，ALK1G309S突變體表現出過度的線性泛素化以及與HOIP的相互作用增加，這導致ALK1G309S的激酶活性較低。隨后，他們利用患者的外周血單核細胞制備出誘導多能干細胞，然后誘導其分化為內皮細胞，并發(fā)現HOIP抑制劑11a能夠校正患者的異常表型。

小結
總的來說，作者通過一系列的實驗，證實了OTULIN與LUBAC協同作用，通過特異性編輯ALK1的線性泛素化來平衡內皮細胞的血管生成。ALK1的過度線性泛素化對血管內皮細胞有害，并導致Otulin-KO小鼠的血管生成缺陷和胚胎致死，這可以通過BMP9處理和ALK1激活來挽救。此外，HOIP抑制劑可使內皮ALK1-Smad1/5正�；�，從而有效對抗與HHT發(fā)病相關的內皮細胞中的血管生成缺陷。
 

原文檢索：

Fu et al., OTULIN allies with LUBAC to govern angiogenesis by editing ALK1 linear polyubiquitin, Molecular Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.05.031