空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序制備高質(zhì)量樣本的方法

10x Genomic Visium空間基因表達(dá)解決方案（Visium Spatial Gene Expression Solution）在確定不同細(xì)胞群的同時(shí)保留空間位置，為細(xì)胞功能、表型和組織微環(huán)境中位置的關(guān)系提供了重要信息。該技術(shù)一經(jīng)問(wèn)世便受到了人們的廣泛關(guān)注，而越來(lái)越多的研究成果也表明了空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)為廣大科研工作者帶來(lái)了前所未有的組織學(xué)研究深度。

秘籍1：組織樣本要篩選 
空間轉(zhuǎn)錄組研究的特點(diǎn)是基于空間物理位置的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，所以組織樣本的選擇是該研究的前提條件。由于空間轉(zhuǎn)錄組捕獲芯片的限制（6.5mmX6.5mm），組織樣本最后上芯片的切片不能超過(guò)該面積范圍。因此，在選擇實(shí)驗(yàn)樣本前，需要對(duì)進(jìn)行研究的樣本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)前期組織學(xué)檢測(cè)，確認(rèn)好樣本的最佳取材位置，最合理組織大小。如果樣本是較大的組織，可以在后續(xù)OCT包埋、切片過(guò)程中被分割（1mm切口的預(yù)冷刀片），避免深切口損傷組織。

秘籍2：樣本保鮮很重要
空間轉(zhuǎn)錄組是針對(duì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的檢測(cè)，因此，新鮮樣本是保證RNA完整性的前提（后續(xù)RNA RIN值＞7）。將新鮮組織樣本取下后迅速用預(yù)冷的PBC溶液或者生理鹽水沖洗組織表面殘留，然后用干凈的紗布或吸水紙吸干液體（防止其他體液在組織表面形成冰晶，影響OCT包埋效果）。

組織冷凍與包埋過(guò)程

秘籍3：樣本凍存不可少
空間轉(zhuǎn)錄組研究平臺(tái)是基于冰凍樣本（基于FFPE樣本的空間測(cè)序須參照石蠟樣本標(biāo)準(zhǔn)制備指南）進(jìn)行研究的，所以在樣本凍存前至少提前10分鐘將異戊烷和液氮浴準(zhǔn)備好（之所以用異戊烷而不直接用液氮進(jìn)行速凍，是因?yàn)橐旱�沸點(diǎn)比較低，直接液氮處理可能在沸騰過(guò)程中使組織周圍形成空穴，導(dǎo)致不同區(qū)域降溫不同步而改變內(nèi)部形態(tài)，甚至組織碎裂）。然后用鑷子或者刮刀將新鮮組織轉(zhuǎn)移到異戊烷中，使組織完全浸沒(méi)且浸泡至少1分鐘。冷凍后，可用鑷子或者刮刀將組織轉(zhuǎn)移到密封的預(yù)冷容器或者凍存管中，-80℃儲(chǔ)存，或者進(jìn)行OCT包埋。

秘籍4：OTC包埋需仔細(xì)
OCT包埋是用來(lái)為后續(xù)切片制作做準(zhǔn)備。將預(yù)冷好的OCT填充入冷凍模具的底部（可做好標(biāo)記，以確認(rèn)組織方向），然后用鑷子迅速將冰凍好的組織放入，并用OCT覆蓋組織，使之完全包埋住。該過(guò)程應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。然后立即將冷凍磨具轉(zhuǎn)移到碎干冰上。當(dāng)OCT變得完全不透明時(shí)，說(shuō)明包埋成功。當(dāng)然，作為強(qiáng)迫癥的你，也可以對(duì)組織進(jìn)行修理，去掉多余部分，留下需要的組織塊。最后，包埋好的組織塊可放置于干冰上運(yùn)輸至-80°C進(jìn)行儲(chǔ)存。

OTC包埋前后對(duì)比

秘籍5：切片制備要適宜
做好冰凍組織包埋工作后，如果實(shí)驗(yàn)室有設(shè)備，可自行進(jìn)行切片制備及相關(guān)組織學(xué)檢測(cè)。以現(xiàn)有研究測(cè)試樣本情況來(lái)看，大部分的樣本切片厚度保持在10-20μm之間為宜。如果沒(méi)有后續(xù)切片設(shè)備進(jìn)行切片制備，可以直接將樣本給我們，我們來(lái)進(jìn)行后續(xù)的工作及空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)。我們會(huì)取OCT包埋樣本的10張切片，用核酸試劑盒抽提RNA并通過(guò)RIN評(píng)估制備樣本的質(zhì)量，RIN>7的樣本，建議做下游組織優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)。

以上就是空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣本制備秘籍的全部?jī)?nèi)容了，你學(xué)會(huì)了嗎？