單細胞+timsTOF揭示傷口再生的動態(tài)圖譜

再生是組織修復的“必殺技”，但皮膚損傷通常會產(chǎn)生纖維化的、無功能的疤痕。疤痕是指皮膚損傷后的纖維化，通過用非功能性結締組織替代功能性組織來確保傷口能夠盡快愈合。由于疤痕沒有皮膚的毛發(fā)或腺體，因此也不具有正常的體溫調(diào)節(jié)或屏障功能。盡管纖維化帶來的醫(yī)療負擔巨大，但目前尚無有效的治療方法，部分原因是缺乏對再生和纖維化愈合的基本機制的了解。所以想要發(fā)展促再生療法，需要深刻理解從損傷到纖維化或再生的分子軌跡。

近日，美國斯坦福大學醫(yī)學院研究組在Cell Stem Cell（IF：24.633）上發(fā)表了一篇題為Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing的文章，該研究以單細胞多組學方式（單細胞轉(zhuǎn)錄組+蛋白質(zhì)組）描繪了YAP抑制背景下瘢痕與傷口再生的分子軌跡。

研究發(fā)現(xiàn)，使用YAP (Yes-associated protein) 抑制劑可以防止成纖維細胞纖維化，并產(chǎn)生ENF (En-1-negative fibroblasts) 介導的再生，這一過程包括真皮附件如毛囊 (HF) 和腺體的恢復、細胞外基質(zhì) (ECM) 的結構與未發(fā)生損傷皮膚 (UW) 的結構相同以及具有相似的彈性。

 纖維化和再生創(chuàng)傷的多模態(tài)分析

研究分析了7個時間點的小鼠創(chuàng)面和皮膚：UW皮膚、術后第2天（炎癥期）、術后第7天（成纖維細胞增殖期）、術后第10天、術后第14天（傷口重新上皮化、成纖維細胞產(chǎn)生細胞外基質(zhì)）、術后第21天和術后第30天（成纖維細胞重塑ECM）。采用夾板切除傷口模型，該模型能夠防止皮膚松弛小鼠典型的傷口快速收縮，從而可以對傷口恢復過程進行監(jiān)控。傷后立即在創(chuàng)面注射YAP抑制劑或?qū)φ站彌_液，對傷口進行長時程多模分析。
 
對照組創(chuàng)面形成明顯的纖維瘢痕，有密集、線性排列的ECM纖維，無毛囊和腺體；而YAP抑制劑處理后的創(chuàng)面，有毛囊和腺體再生，ECM纖維密度較低，且生長方向更隨機。通過YAP敲除對該結果進行再次確認，抑制劑與對照組之間處理的差異并非由于抑制劑的脫靶效應引起。
 
根據(jù)FACS策略進行細胞分類，分離成纖維細胞(Lin-) 和其他細胞 (主要是免疫細胞；Lin+)。對一半的細胞進行scRNA-seq分析，總計2986個細胞。發(fā)現(xiàn)成纖維細胞在YAP抑制劑處理的創(chuàng)面中輕微增加；然而，對照組和YAP抑制劑創(chuàng)面的細胞比例大體相似，這表明YAP、抑制劑可能通過改變細胞表型而不是相對表征（或通過改變細胞類型中的亞群表征）來誘導再生。剩余的細胞進行蛋白質(zhì)組學分析（timsTOF質(zhì)譜分析）。主成分分析發(fā)現(xiàn)Lin-和Lin+蛋白組學標本在不同時間點上差異很大，而PBS樣本和YAP抑制劑樣本的差異則比較狹窄，這表明蛋白質(zhì)組學分析可以在更廣泛的修復動力學中捕獲連貫的纖維化變化。

疤痕形成與再生創(chuàng)面修復的多模態(tài)分析

(B) 創(chuàng)傷愈合隨時間變化的小鼠配對多模態(tài)分析實驗策略。

(C) 按細胞類型（左上）、處理組（右上）、小鼠個體（左下）和POD（右下）著色的scRNA-seq細胞的多重投影。

(D) PBS和維替泊芬（YAP抑制劑）處理的傷口按時間點的細胞類型比例。

(E) Lin-（成纖維細胞，上）和Lin+（非成纖維細胞，下）細胞。

(F) 頂部，量化294個ECM參數(shù)的圖像處理和分析管道示意圖輪廓。底部為對照（左）和椎體芬（右）傷口隨時間的t-SNE圖。綠色陰影區(qū)域，UW皮膚簇；疊加箭頭，ECM隨時間演化。

識別修復的分子軌跡

因為成纖維細胞是瘢痕形成的主要驅(qū)動因素，研究假設YAP抑制劑通過改變成纖維細胞表型促進再生，并將scRNA-seq分析集中在成纖維細胞上。單細胞分析發(fā)現(xiàn)再生過程和纖維化過程并不是相互排斥的，具有促再生活性的細胞可能存在于瘢痕創(chuàng)面之中，但是在沒有干預的情況下（例如YAP抑制劑處理），促纖維化分子的反應會覆蓋再生的活性，并導致纖維化瘢痕表型。

此外，還分析了另外兩種與傷口相關的細胞亞群：骨髓細胞和淋巴細胞。髓系細胞假時間分析顯示，炎癥基因（如Ccl6、Ccl9和Cxcl2）在早期富集，抗原呈遞基因（如H2復合物）在后期富集。然而，這些基因在PBS和YAP抑制劑細胞中表達相似，表明該分析沒有區(qū)分纖維化和再生愈合。淋巴樣細胞假時間分析也沒有區(qū)分纖維化和再生的傷口，而是分別反映了早期和晚期的NK和B/T細胞浸潤。發(fā)現(xiàn)抑制劑處理與對照組相比，免疫細胞的組成并沒有出現(xiàn)太大的差異。因此，疤痕表型是否產(chǎn)生并非是由于免疫細胞的差異，其原因可能還是主要集中在成纖維細胞之中。

使用CellChat分析scRNA-seq數(shù)據(jù)。CellChat強調(diào)了再生臂中涉及疤痕 (PBS) 成纖維細胞和非典型Wnt信號的促炎信號（如CXCL和IL6）的增加。這些獨特的功能富集項，以及該組中較低的Dpp4表達，暗示了由非瘢痕性ENF設計的獨特的分子愈合軌跡。
 

成纖維細胞相互作用的CellChat分析

(A)  細胞群對間配體-受體相互作用的強度。邊緣寬度與配體-受體對的數(shù)量成正比。

(B)  如(A)中，按細胞種群劃分的子集。

(C)  熱圖顯示了基于指定信號網(wǎng)絡(ncWNT, noncanonical Wnt)的計算網(wǎng)絡中心性度量的每個細胞群的相對重要性。

(D和E)推斷出的分泌細胞輸出(D)和輸入(E)通信模式，顯示出推斷出的潛伏模式和細胞群之間的對應關系(左)和信號通路(右)。

傷口纖維化和再生軌跡標記物的研究

基于綜合多模態(tài)分析，試圖驗證不同創(chuàng)傷表型中關鍵基因的相關性。圖譜中差異表達的基因指向了Wnt信號通路，包括Wnt的靶標基因、拮抗基因以及一個重要的調(diào)節(jié)因子Trps1。先前的研究表明Trps1是Wnt信號通路的主要調(diào)節(jié)因子，且與皮膚腺體的發(fā)育、生長和增殖相關。通過Trps1基因敲除以及過表達實驗，研究確認該基因?qū)τ趥�口再生是必要且充分的。支持了ENF介導的愈合（低Dpp4）在YAP抑制（低Ankrd1）的傷口中通過Wnt激活（高Trps1和Rspo1）實現(xiàn)HF再生這一發(fā)現(xiàn)。

確定Trps1在再生中的功能意義

鑒于Trps1在Wnt信號轉(zhuǎn)導、HF形態(tài)發(fā)生和YAP調(diào)控中的重要性，以及Trps1+成纖維細胞和HF再生的空間關系，研究試圖確定Trps1在創(chuàng)面再生中的作用。綜合多模態(tài)分析區(qū)分了兩種修復軌跡。第一種是EPF介導的 (Dpp4+)，以機械激活（高核YAP，Ankrd1+，Trps1-）為特征，導致疤痕ECM。二是ENF介導 (Dpp4-)，缺乏機械活化（低核YAP，Ankrd1-，Trps1+），并通過Wnt激活導致正常ECM和HF的再生。
總結一下，該研究通過對傷口再生進行YAP抑制劑處理后的長時程多模分析，建立了傷口再生的分子生物學、細胞生物學以及蛋白質(zhì)圖譜，對研究皮膚傷口再生與纖維化瘢痕形成的阻斷具有重要價值。

參考文獻：

Mascharak S, Talbott HE, Januszyk M,Griffin M, Chen K, Davitt MF, Demeter J, Henn D, Bonham CA, Foster DS, MooneyN, Cheng R, Jackson PK, Wan DC, Gurtner GC, Longaker MT. Multi-omic analysisreveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing.Cell Stem Cell. 2022 Feb 3;29(2):315-327.e6. doi: 10.1016/j.stem.2021.12.011.Epub 2022 Jan 24. PMID: 35077667.