測序表明MBD5、MBD6和SILENZIO在發(fā)育花粉的營養(yǎng)細胞中沉默基因表達
影響因子：7.5
主要技術：單細胞核RNA測序（snRNA-seq）
導語
轉座元件（TEs）的沉默驅動了轉錄調控機制的演化,擬南芥MBD5、MBD6和SILENZIO是DNA甲基化下游的TE抑制因子。本文對發(fā)育中雄配子體的單核RNA測序分析結果顯示，這些抑制因子對花粉營養(yǎng)細胞(VN)中的TE沉默至關重要，而VN是受精過程中一種重要的輔助細胞，同時發(fā)生染色質開放。其他沉默突變體（met1，ddm1，mom1，morc）在所有花粉核類型和體細胞中表現(xiàn)出沉默的喪失。作者發(fā)現(xiàn)，被MBD5/6抑制的TE在野生型營養(yǎng)細胞核中獲得染色質可及性，表明染色質開放狀態(tài)下，它們對mbd 5/6的損失更為敏感。同樣mbd 5/6 h1突變體，染色質開放性增強，mbd 5/6依賴的TE在葉中去阻遏。因此，mbd 5/6和SILENZIO作為沉默系統(tǒng)，在染色質致密化受損時特別重要。
技術服務
單細胞核RNA測序（snRNA-seq）
研究結果
1. 發(fā)育花粉中，mbd 5/6 TE去抑制表型最為顯著
花序組織中，mbd 5/6和sln突變體植物顯示出少量TE和受DNA甲基化調控的基因輕度去阻遏，如基因FWA。為探究沉默喪失是否僅發(fā)生在花內的特定細胞類型中，作者將未開放的花蕾中含有發(fā)育中花粉粒的花粉囊與花蕾的其余部分（包括心皮、花瓣和萼片）分離（簡稱“無花粉囊”）（圖1A），進行RNA-seq測序以比較野生型、mbd 5/6和sln突變型中的基因表達譜。結果顯示mbd 5/6和sln突變體中的FWA去阻遏僅發(fā)生在花藥中（圖1B）。作者構建了轉錄報告細胞系，通過GUS指示FWA的表達，結合DAPI染色，確定了在花藥組織內，F(xiàn)WA僅在雄配子體中從花粉發(fā)育的早期階段被重新激活，并且其表達在成熟花粉中降低。
圖1 mbd 5/6中FWA去阻遏僅限于發(fā)育中的花粉粒
作者進一步研究和比較了幼苗、未開放花蕾和成熟花粉中的基因表達模式。發(fā)現(xiàn)成熟花粉中的上調差異基因數(shù)明顯高于幼苗和花蕾（圖2A）。統(tǒng)計不同組織中差異倍數(shù)的分布，發(fā)現(xiàn)花粉up-DEG在花蕾中也多上調表達，只是上調幅度較低（圖2B），在幼苗中不上調（圖2B）。而甲基化突變體metl中觀察到，約一半的花粉DEG在幼苗中也上調（圖2B），作者猜測一部分mbd 5/6花粉DEG在幼苗中被DNA甲基化抑制，且mbd 5/6損失不足以重新激活它們。
2. mbd 5/6突變體中，花粉中上調的轉錄本多是被CG甲基化抑制的基因或TE
分析花粉RNA-seq數(shù)據集，該數(shù)據集包括mbd 5和mbd 6單突變體，三種不同的mbd 5/6雙突變體等多種突變體，分析結果顯示mbd 5/6靶標大多是異染色質基因座，且主要是由CG甲基化抑制。MBD5和MBD6廣泛調節(jié)被CG甲基化抑制的TE家族。作者還鑒定了一些與FWA相似的功能基因，具有啟動子甲基化并被mbd 5/6和MET 1抑制。在研究的組織中，mbd 5/6和sln的轉錄表型在花粉中最強，并且MBD5/6靶標是被CG甲基化抑制的基因和TE。
圖2 mbd 5/6轉錄去阻遏表型的組織特異性
3. snRNA-seq揭示了發(fā)育中的雄配子體細胞核的轉錄景觀
因花粉粒含有不同的細胞核類型，作者使用snRNA-seq來確定在花粉發(fā)育過程中哪些特定的細胞核發(fā)生了轉錄變化。單細胞結果中，作者鑒定到了小孢子核（MN）、精子核（SN）、營養(yǎng)核（VN）、生殖核（GN）、和一些污染核（圖3C、D）。UMAP中，可以清晰看到VN的發(fā)育軌跡：從雙細胞階段到三細胞和成熟花粉（標記為VN1至VN5）（圖3C）。此外作者還鑒定了GN1、GN2、MN1、MN2和MN3，并詳細分析了各個簇中的基因表達模式，如DNA甲基轉移酶、小RNA機制的表達模式、組蛋白變體等�？偟膩碚f，該snRNA-seq數(shù)據集提供了擬南芥雄配子體發(fā)育過程中整體基因表達譜，是相關研究的重要基礎。
圖3 發(fā)育中的雄配子體的snRNA測序
4. MBD5/6靶標在VN譜系中去阻遏
為研究花粉發(fā)育期間mbd 5/6去阻遏的細胞類型特異性，作者對ColO、mbd 5/6和sln突變體進行snRNA-seq（圖4A）。發(fā)現(xiàn)mbd 5/6中，F(xiàn)WA基因在小孢子晚期表達增加，在雙細胞花粉的VN中達到峰值，在VN的雙細胞晚期開始降低（圖4B）。作者將mbd 5/6與每個簇的野生型進行差異比較，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)DEG在早期或晚期VN簇中上調（圖4C），這些基因的特征是啟動子甲基化，其中包括幾個TE和新的注釋（圖4C和4E）。進一步分析VN發(fā)育軌跡，發(fā)現(xiàn)這些DEG中，54個基因在早期VN中表達，然后沉默。83個DEG基因在晚期VN中上調（圖4F）。有趣的是，在野生型中也觀察到了同樣的模式，但幅度要低得多。表明去阻遏的階段特異性可能反映了所需發(fā)育階段特異性轉錄因子的表達�？偟膩碚f，snRNA-seq數(shù)據揭示mbd 5/6和sln中沉默的喪失開始于小孢子晚期，并且在VN中沿著其發(fā)育軌跡逐漸變得更加突出，而GN和SN不受影響。
圖4 mbd 5/6中的轉錄去抑制僅限于MN/VN譜系
5. 其他沉默突變體在所有花粉核類型中都表現(xiàn)出廣泛的去阻遏作用
為探究參與甲基化DNA沉默的其他基因中的突變是否可能顯示出與mbd 5/6相似的模式，作者用一組具有TE去阻遏的突變體及對應的野生型進行了雄性配子體snRNA-se，并注釋到了對應于花粉發(fā)育的最成熟階段（VN4、VN5、SN）的相對較少的細胞，這可能是由于metl植物中花發(fā)育的表型缺陷（圖5A）。
差異分析結果顯示，在met1、ddm1、mom1、morc等突變體，與mbd5/6和sln的DEG明顯不同，且各突變株的不同細胞類型中上調表達的基因也有不同。比較不同突變體的上調DEG發(fā)現(xiàn)，雖然大部分mbd 5/6靶標在metl和ddm1中上調，但它們在mom1或morc中沒有上調（圖5F）。同樣，mom1和morc靶標主要是met1和ddm1靶標的子集，并且它們彼此很大程度上重疊，但在mbd 5/6中沒有上調（圖5F）。因此，作者猜測MBD5/6靶標構成了由DNA甲基化調控的基因座的獨特子集。
圖5 met1、ddm1、mom1和morc突變體在所有花粉細胞中表現(xiàn)出沉默缺失
6. 組蛋白H1的缺失揭示了mbd 5/6和sln在非生殖組織中的去阻遏表型
為探究VN細胞中的松弛染色質狀態(tài)是否與mbd 5/6中沉默喪失的VN特異性有關，作者分析了包括從野生型GN、SN和成熟VN分離的細胞核進行的轉座酶可及染色質測序結果。作者觀察到，在野生型VN中，mbd 5/6靶標處染色質可及性明顯增加，并且在VN中失去更多的CG甲基化，這可能是因為啟動子的開放性促進DME的接近（圖6B）。然而，雖然VN中特定花粉育性基因的DME介導的去甲基化是非常廣泛的，導致這些基因高度表達并且不受mbd 5/6調節(jié)，但是mbd 5/6靶標處的甲基化損失較溫和，并且僅導致野生型VN中非常低的表達水平（圖6B-E）。
圖6 mbd 5/6靶點的特征是野生型VN中的可及性增加
作者猜測，在mbd 5/6和sln幼苗中沒有可檢測到的TE去阻遏的原因可能是染色質高度壓縮補償了甲基閱讀器的損失，并且足以維持基因沉默。為了驗證這個想法，作者將mbd5/6和sln與h1.1/h1.2雙突變體（簡稱h1，幼苗染色質去致密化）雜交。RNA-seq結果顯示，mbd5/6或sln幼苗中不表達的FWA基因在h1中低表達，而在mbd5/6 h1和sln h1中明顯增強。此外，約有50個基因在mbd5/6和sln中表現(xiàn)出上調，而在mbd5/6 h1或sln h1中上調更加顯著。表明mbd 5/6和sln在更廣泛的組織中具有基因沉默功能，但其他沉默途徑阻止了VN以外的大多數(shù)細胞中靶基因的上調。
圖7 H1突變增強了幼苗中mbd 5/6的去阻遏表型
參考文獻：
[1] Ichino L, Picard CL, Yun J, et al (2022) Single-nucleus RNA-seq reveals that MBD5, MBD6, and SILENZIO maintain silencing in the vegetative cell of developing pollen. Cell Rep 41:111699. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111699
