PacBio單分子測序最新科研動態(tài)

2014年6月10日，中科院藥用植物研究所（IMPLAD）劉昶團隊在《PLOS ONE》雜志上發(fā)表了利用

PacBio測序技術(shù)揭示丹參（Salvia miltiorrhiza）葉綠體DNA修飾之間復(fù)雜相互作用的相關(guān)文章，該文章報道了丹參葉綠體中編碼及非編碼RNA的表達情況。這也是國內(nèi)PacBio第三代測序用戶在國際性雜志發(fā)表的第一篇文章。

丹參是最廣泛使用的藥用植物之一。作為基于葉綠體基因工程手段開發(fā)使丹參活性成分過表達方法的第一步，該研究團隊從基因組，轉(zhuǎn)錄組，和堿基修飾三方面對丹參葉綠體進行了分析。先從新鮮葉片中提取總基因組DNA和RNA，然后進行鏈特異性RNA測序和PacBio公司的單分子實時（Single-Molecule Real-Time, SMRT）測序分析。

實驗先是將RNA測序得到的reads mapping到基因組，使該研究小組確定了80個蛋白質(zhì)編碼基因的相對表達水平。此外，還明確了19個多順反子轉(zhuǎn)錄單元和136個假定反義和基因間非編碼RNA（ncRNA）基因。將蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄本（cRNA）豐度與重疊反義非編碼RNA（asRNA）相比較表明，asRNA的存在與cRNA的豐度增加有關(guān)（P<0.05）。使用SMRT Portal軟件預(yù)測到了2687個潛在的DNA修飾位點和2個潛在的DNA修飾基序。兩個基序包括TATA盒樣基序（CPGDMM1, ''TATANNNATNA''），以及一個未知的基序（CPGDMM2,  ''WNYANTGAW''）。

研究采用二代和三代DNA測序技術(shù)并用，使在基因組層面研究非編碼RNA和DNA修飾成為可能。然而，原來關(guān)于反義RNA和DNA修飾研究在實驗上具有相當大的困難。首先，大多數(shù)asRNA轉(zhuǎn)錄本表達水平顯著偏低，因而難以用經(jīng)典技術(shù)如Northern Blot和原位雜交進行驗證。第二，正義和反義轉(zhuǎn)錄本之間錯綜復(fù)雜的關(guān)系意味著實驗擾動會不可避免地干擾其他轉(zhuǎn)錄本的表達。因此，通過knocking-in和knocking-out技術(shù)確定轉(zhuǎn)錄本的生物學(xué)功能是復(fù)雜的。第三，雖然SMRT技術(shù)已被證明能夠檢測到潛在的DNA修飾，但驗證這些修飾仍然是個挑戰(zhàn)性的任務(wù)。第四，葉綠體asRNA和DNA修飾的存在和功能的驗證是更加困難的。

綜上所述，本研究所描述的一些發(fā)現(xiàn)從目前的技術(shù)上來講是有巨大進步的。然而，本研究提出的數(shù)據(jù)已經(jīng)證實了由asRNA和DNA修飾引起的基因表達調(diào)控的復(fù)雜性。

二，三代基因測序組裝算法和軟件研發(fā)獲突破

“第三代測序技術(shù)”的研發(fā)已有近十年時間，商業(yè)化的第三代測序儀上市也有三年。但目前測序市場仍為二代測序技術(shù)所壟斷（我國頂級科研機構(gòu)和商業(yè)公司所擁有的三代測序儀可能僅有數(shù)十臺）。三代測序技術(shù)產(chǎn)生的讀段更長，測序成本更低，其取代二代技術(shù)是測序技術(shù)發(fā)展的必然趨勢。然而由于三代測序技術(shù)錯誤率高，現(xiàn)有的組裝軟件多是對第二代測序數(shù)據(jù)組裝軟件的“修補”而并沒有充分考慮到三代測序技術(shù)的數(shù)據(jù)特征。事實上，基因組裝算法問題被廣泛認為是計算生物學(xué)和生物信息學(xué)領(lǐng)域最復(fù)雜的計算難題之一，也是目前阻礙基因測序產(chǎn)業(yè)從二代技術(shù)升級到三代技術(shù)最大的技術(shù)障礙。

最近，美國馬里蘭大學(xué) Chengxi Ye, James A. Yorke, Aleksey Zimin 等與中國科學(xué)院昆明動物研究所遺傳資源與進化國家重點實驗室馬占山研究員在這一領(lǐng)域的合作研發(fā)取得新突破。該研究團隊在一篇題為DBG2OLC: Efficient Assembly of Large Genomes Using the Compressed Overlap Graph 的文章中引入了一種新的針對三代測序技術(shù)的基因組裝算法，并開發(fā)出一款軟件（DBG2OLC）。另外作者（Ye et al. 2011, 2012)于2011年發(fā)布的SparseAssembler曾經(jīng)比當時主流的基因組裝軟件節(jié)省90%的內(nèi)存空間，而其計算時間和組裝質(zhì)量卻毫不遜色。著名的SOAPdenovo的升級版，也是目前最廣泛應(yīng)用的基因組裝軟件SOAPdenovo2即采用了SparseAssembler算法。

多組測序數(shù)據(jù)的測試表明：與目前用于三代測序最優(yōu)秀的一些基因組裝軟件（例如PacBio2CA, HGAP, ECTools）相比，DBG2OLC在計算時間和內(nèi)存空間的消耗通常僅為其它算法的1/10。理論上，DBG2OLC 在時間和空間的使用上相對其它同類軟件可減少達1000倍。例如組裝關(guān)鍵步驟之一的“兩兩比對”計算，采用一組由 PacBio提供的人類基因組數(shù)據(jù)，DBG2OLC 使用一臺普通PC僅用了6小時完成。而同樣計算，Pacific Biosciences所報道的時間為 405000 CPU小時，而且是在Google的計算集群上完成。因此，DBG2OLC 算法基本解決了目前三代測序技術(shù)所面臨的計算技術(shù)挑戰(zhàn)，從而為推進基因測序技術(shù)的產(chǎn)業(yè)升級奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

三，PacBio RS II 測序系統(tǒng)原理

PacBio RS測序儀系統(tǒng)能夠?qū)�單個DNA（脫氧核糖核酸）分子進行測序，而目前市場上的主流測序儀只能對分子群體進行平均測序。單分子測序能對DNA中罕見的序列變異進行分析，也不需要在測序之前對DNA樣本進行放大，因為放大過程可能引發(fā)錯誤，導(dǎo)致對某個DNA序列檢測失敗。其工作原理是用一種聚合酶將DNA的復(fù)制限制在一個微小的間隙中，給各種堿基加上熒光示蹤標記，當堿基合成DNA鏈時，這些熒光標記就會發(fā)出不同顏色的閃光，根據(jù)閃光顏色就可識別出不同的堿基。

四，PacBio RS II 測序系統(tǒng)特點

     1、測序讀長長：平均測序讀長能達到3，000至5，000堿基，最長的序列能達到20，000堿基；

      2、準確率高：對基因組組裝和基因組變異檢測，可以最多達到99.999%的準確率；選用特殊測序模式，測序準確率可以在達到單個分子99%準確率的條件下，讀長超過經(jīng)典的Sanger測序法；

      3、極度的敏感性：可以檢測頻率在0.1%的 minor variants；

       4、直接檢測廣泛的堿基修飾：除了5-methylcytosine修飾以外， 還可以檢測N6-methyladenine, N4-methylcytosine, DNA氧化損傷 以及其它堿基的修飾.

      5、GC偏向性（GC bias）小：在極端高GC和極端低GC區(qū)域，可以輕松測定，從而保證序列的均勻覆蓋度；

     6、無PCR擴增偏向性：樣本不需要進行PCR擴增，避免了覆蓋度不均一和PCR artifacts.