m6A RNA甲基化在發(fā)表多篇10+文章的運用
導讀
最近小編檢索了關于m6A修飾的文章發(fā)表情況，發(fā)現目前2020年發(fā)表的關于m6A修飾的文章已經達到309篇，已經追平2019年整年度發(fā)表篇數，可以預見m6A RNA修飾下半年年發(fā)表文章會呈現出爆炸式增長。
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圖1. 近6年m6A RNA修飾相關文章發(fā)表情況（ data from PubMed）
那么您是否已經了解m6A修飾10+ 高分文章的研究思路呢？剛好小編讀到一篇關于m6A修飾的文章，可謂也是我們推薦的m6A修飾常見的研究模式（RNA修飾與關鍵酶），思路之清晰、手段之全面、機制之詳盡，其他生物學過程/領域完全或部分都可以套用這篇文章的思路，10 +文章妥妥的！！強烈建議收藏！！讓我們來重溫如何玩轉m6A修飾10+文章！
Molecular Cancer （IF=10.679）雜志刊登了m6A修飾最新研究：m6A依賴的糖酵解增強結直腸癌（CRC）發(fā)生發(fā)展。該文章采用多組學聯合應用技術檢測了Mettl3-KO(m6A甲基化轉移酶敲除細胞株)和WT HCT116（結直腸癌細胞株）甲基化修飾，這項研究揭示METTL3通過m6A-IGF2BP2/3-依賴性機制穩(wěn)定HK2和SLC2A1 (GLUT1)在CRC中表達，表明m6A修飾的糖酵解途徑可以促進結直腸癌的發(fā)展，同時為以METTL3及其途徑為靶點高糖代謝的CRC患者提供了合理的治療靶點和治療方向。
發(fā)表期刊：Molecular Cancer
影響因子：10.679
發(fā)表時間： 2020.4.3
影響因子：10.679
發(fā)表時間： 2020.4.3
實驗方法: m6A-seq, RNA-seq，MeRIP-qPCR, RIP等（云序可提供以上服務）
文章鏈接： m6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression
文章內容
（1）尋找RNA修飾關鍵酶METTL3
為了探尋m6A修飾與結直腸癌（CRC）的糖酵解代謝的相關性，采用qPCR檢測結直腸癌患者體內脫氧葡萄糖吸收（FDG uptake）和m6A修飾相關酶表達的情況，發(fā)現Mettl3（m6A甲基化轉移酶）的表達與FDG攝取存在明顯的相關性。
圖2. 結直腸癌患者體內Mettl3表達與FDG吸收相關
同時檢測到在CRC體內Mettl3高表達和葡萄糖代謝強烈保持一致，那么在結直腸癌患者體內FDG和Mettl3的變化是否影響甲基化整體水平的變化呢？作者采用多種方法檢測高FDG CRC和低FDG CRC患者體內甲基化水平，結果表明m6A修飾水平在這些FDG攝取較高的CRC患者中也顯著升高。
圖3. 甲基化化水平與FDG的關系
為了進一步說明Mettl3在CRC糖酵解過程中促進腫瘤發(fā)展的作用，作者通過RNA-seq(云序可提供此服務)分析比較Mettl3 KO和野生型的細胞（WT HCT116 CRC）基因表達情況。通過GO和KEGG分析，WT HCT116主要富集與葡萄糖代謝相關的信號通路，而Mettl3 KO細胞基因富集與糖酵解，葡萄糖反應物運輸，糖異生等途徑呈負相關。而進一步質譜代謝組學分析表明敲除Mettl3明顯減少糖酵解途徑關鍵成分的水平，如葡萄糖-6-磷酸，果糖- 1,6-二磷酸，丙酮酸和乳酸等。
圖4. Mettl3參與CRC糖酵解過程
通過上面數據的分析，表明Mettl3可能介導CRC患者糖酵解代謝和癌變，因此可以確定以Mettl3作為CRC 糖酵解研究的關鍵RNA修飾酶。
（2）干預酶METTL3觀察功能
為了進一步驗證酶Mettl3的功能，通過敲除Mettl3后，乳酸（糖酵解的關鍵代謝物）的產生和葡萄糖的攝取均明顯下降。為了弄清Mettl3的改變是否會直接影響糖酵解代謝，同時測量了CRC細胞的胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)，結果顯示敲除Mettl3可顯著降低HCT116和sw480細胞的ECAR水平，卻不影響OCR水平。為了闡明Mettl3誘導的CRC糖酵解是否依賴于其甲基轉移酶功能，我們構建了Mettl3野生型(pcDNA3.1-Mettl3)和突變型(pcDNA3.1-Mettl3-mut，帶有MTase結構域缺失)重組質粒。過表達Mettl3顯著增加了乳酸的產生，葡萄糖吸收和ECAR水平。而且在CRC中，Mettl3的MTase結構域的缺失阻斷了Mettl3誘導的糖酵解過程, 這些數據表明Mettl3通過其甲基轉移酶結構域調控結直腸癌糖酵解代謝。
（2）干預酶METTL3觀察功能
為了進一步驗證酶Mettl3的功能，通過敲除Mettl3后，乳酸（糖酵解的關鍵代謝物）的產生和葡萄糖的攝取均明顯下降。為了弄清Mettl3的改變是否會直接影響糖酵解代謝，同時測量了CRC細胞的胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)，結果顯示敲除Mettl3可顯著降低HCT116和sw480細胞的ECAR水平，卻不影響OCR水平。為了闡明Mettl3誘導的CRC糖酵解是否依賴于其甲基轉移酶功能，我們構建了Mettl3野生型(pcDNA3.1-Mettl3)和突變型(pcDNA3.1-Mettl3-mut，帶有MTase結構域缺失)重組質粒。過表達Mettl3顯著增加了乳酸的產生，葡萄糖吸收和ECAR水平。而且在CRC中，Mettl3的MTase結構域的缺失阻斷了Mettl3誘導的糖酵解過程, 這些數據表明Mettl3通過其甲基轉移酶結構域調控結直腸癌糖酵解代謝。
圖5. Mettl3驅動CRC中的糖酵解代謝
（3）干預酶METTL3觀察細胞表型
進一步探索Mettl3對CRC細胞表型的影響，通過敲除酶Mettl3，一些關鍵的致癌基因表達受到抑制，如CDK1、PCNA、和CDCA7；觀察到Mettl3敲除消除了細胞增殖、群落形成和腫瘤的生長；過表達Mettl3卻促進了細胞增殖、群落形成和腫瘤的生長；并且使用2-DG(一種糖酵解途徑的抑制劑)處理明顯阻斷Mettl3誘導細胞增殖和群落形成。這些結果表明Mettl3可能是一種腫瘤驅動基因，通過調控結直腸癌糖代謝促進CRC進展。
進一步探索Mettl3對CRC細胞表型的影響，通過敲除酶Mettl3，一些關鍵的致癌基因表達受到抑制，如CDK1、PCNA、和CDCA7；觀察到Mettl3敲除消除了細胞增殖、群落形成和腫瘤的生長；過表達Mettl3卻促進了細胞增殖、群落形成和腫瘤的生長；并且使用2-DG(一種糖酵解途徑的抑制劑)處理明顯阻斷Mettl3誘導細胞增殖和群落形成。這些結果表明Mettl3可能是一種腫瘤驅動基因，通過調控結直腸癌糖代謝促進CRC進展。
圖6. Mettl3誘導的細胞存活依賴于糖酵解代謝
（4）m6A-seq & RNA-seq聯合尋找酶靶點
通過關鍵酶的尋找和干預酶的功能，確定RNA修飾酶與腫瘤的聯系，那么怎樣尋找酶的作用靶點才是整篇文章的核心工作。作者這里利用m6A-seq和RNA-seq聯合分析（云序可提供此服務）檢測Mettl3敲除和WT HCT116細胞RNA修飾和RNA表達情況。Motif分析GGACG與經典的m6A修飾基序“GGAC”相似，而且80% Mettl3結合甲基化位點位于CDS區(qū)。與WT HCT116細胞相比，敲除Mettl3后有2363甲基化位點明顯下調，584甲基化位點明顯上調。利用甲基化和轉錄組表達聯合分析，找到甲基化水平下降，同時mRNA表達水平也下降，與糖酵解密切相關的靶分子-HK2和SLC2A1(GLUT1)。
通過關鍵酶的尋找和干預酶的功能，確定RNA修飾酶與腫瘤的聯系，那么怎樣尋找酶的作用靶點才是整篇文章的核心工作。作者這里利用m6A-seq和RNA-seq聯合分析（云序可提供此服務）檢測Mettl3敲除和WT HCT116細胞RNA修飾和RNA表達情況。Motif分析GGACG與經典的m6A修飾基序“GGAC”相似，而且80% Mettl3結合甲基化位點位于CDS區(qū)。與WT HCT116細胞相比，敲除Mettl3后有2363甲基化位點明顯下調，584甲基化位點明顯上調。利用甲基化和轉錄組表達聯合分析，找到甲基化水平下降，同時mRNA表達水平也下降，與糖酵解密切相關的靶分子-HK2和SLC2A1(GLUT1)。
圖7. m6A-seq和RNA-seq聯合分析
進一步通過靶分子HK2和SLC2A1進行表達水平（qPCR）、甲基化水平(MeRIP-qPCR)的驗證（云序可提供此服務)，充分證實靶分子作為Mettl3直接調控CRC糖代謝的靶點。
圖8 . 靶分子表達和甲基化水平驗證
（5）酶METTL3作用分子機制
研究已表明Mettl3是一種甲基化轉移酶，可以調控靶分子的甲基化水平，那么是如何調節(jié)糖代謝過程呢？現有實驗已表明Mettl3敲除或過表達不僅影響HK2和SLC2A1的甲基化水平，還調節(jié)HK2和SLC2A1的表達水平，這暗示著靶分子甲基化水平影響其表達，而雙熒光素酶實驗恰好證實了這一點。已有機制表明甲基化可以促進RNA分子的穩(wěn)定，那HK2和SLC2A1甲基化是否也影響其穩(wěn)定性呢？作者通過穩(wěn)定性分析，發(fā)現敲除Mettl3降低了HK2和SLC2A1 mRNA的半衰期，也就是說甲基化促進了HK2和SLC2A1 mRNA分子的穩(wěn)定從而影響其表達。作者進一步通過RIP-qPCR（云序可提供此服務）證實了 IGF2BP2（m6A識別蛋白促進mRNA穩(wěn)定）與HK2結合，IGF2BP2/3與SLC2A1結合。這些數據揭示了Mettl3介導的m6A修飾通過IGF2BP2依賴和IGF2BP2/3依賴的mRNA穩(wěn)定性調節(jié)，分別增加了HK2和SLC2A1 (GLUT1)的表達。
研究已表明Mettl3是一種甲基化轉移酶，可以調控靶分子的甲基化水平，那么是如何調節(jié)糖代謝過程呢？現有實驗已表明Mettl3敲除或過表達不僅影響HK2和SLC2A1的甲基化水平，還調節(jié)HK2和SLC2A1的表達水平，這暗示著靶分子甲基化水平影響其表達，而雙熒光素酶實驗恰好證實了這一點。已有機制表明甲基化可以促進RNA分子的穩(wěn)定，那HK2和SLC2A1甲基化是否也影響其穩(wěn)定性呢？作者通過穩(wěn)定性分析，發(fā)現敲除Mettl3降低了HK2和SLC2A1 mRNA的半衰期，也就是說甲基化促進了HK2和SLC2A1 mRNA分子的穩(wěn)定從而影響其表達。作者進一步通過RIP-qPCR（云序可提供此服務）證實了 IGF2BP2（m6A識別蛋白促進mRNA穩(wěn)定）與HK2結合，IGF2BP2/3與SLC2A1結合。這些數據揭示了Mettl3介導的m6A修飾通過IGF2BP2依賴和IGF2BP2/3依賴的mRNA穩(wěn)定性調節(jié)，分別增加了HK2和SLC2A1 (GLUT1)的表達。
圖8 . 靶分子與識別蛋白的結合
（6）靶分子HK2和SLC2A1功能驗證
HK2己糖激酶和SLC2A1（GLUT1）葡萄糖轉運體1都是糖酵解途徑重要的調節(jié)基因，通過回補實驗研究HK2和SLC2A1 (GLUT1)是否參與Mettl3在CRC中的生物學功能，HK2或SLC2A1 (GLUT1)過表達恢復了HCT116 Mettl3敲除細胞中乳酸的減少和葡萄糖攝取下降，顯然HK2和SLC2A1 (GLUT1)介導了Mettl3在CRC細胞中的調控功能。
HK2己糖激酶和SLC2A1（GLUT1）葡萄糖轉運體1都是糖酵解途徑重要的調節(jié)基因，通過回補實驗研究HK2和SLC2A1 (GLUT1)是否參與Mettl3在CRC中的生物學功能，HK2或SLC2A1 (GLUT1)過表達恢復了HCT116 Mettl3敲除細胞中乳酸的減少和葡萄糖攝取下降，顯然HK2和SLC2A1 (GLUT1)介導了Mettl3在CRC細胞中的調控功能。
圖9. 靶分子HK2和SLC2A1功能驗證
總結：
綜上所述，本文作者通過m6A-seq，RNA-seq，MeRIP-PCR，RIP-PCR等多種技術手段首次發(fā)現了m6A修飾與結直腸癌患者糖酵解途徑激活密切相關。其機制是HK2和GLUT1受m6A修飾調控并參與結直腸癌的糖酵解激活，而Mettl3介導HK2和GLUT1的m6A修飾依賴于IGF2BPs對調控CRC的發(fā)病機制至關重要，所以靶向Mettl3及其通路可能有望用于治療高糖代謝的結直腸癌患者。
圖10. m6A修飾依賴于糖酵解參與結直腸癌發(fā)展機制
相信大家也對m6A功能機制探討的思路有了更清晰的認知，那么研究過程中這些技術手段的使用是否會成為一種門檻呢？我們要說不，因為今天云序生物給大家?guī)砹诵碌母＠a品，提供RNA修飾研究一站式服務，讓老師不再為技術問題而困擾，快速高效幫助老師將RNA修飾與自己的課題研究結合起來，深入挖掘RNA修飾功能機制探討，我們來看看云序生物此次帶來m6A研究重磅產品。
云序生物m6A-全轉錄組測序大促銷
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1）m6A修飾PCR芯片 new！
云序生物提供m6A修飾PCR芯片檢測，高效一次性檢測m6A相關的Writer，Eraser，Reader的表達情況，m6A PCR 芯片基因列表（34 個基因）-human如圖：
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云序生物提供多種RNA修飾PCR芯片檢測，高效一次性檢測6種RNA修飾相關的Writer，Eraser，Reader的表達情況，最全面的RNA修飾相關基因覆蓋，RNA 修飾芯片基因列表（68 個基因）-human如圖：
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云序生物RNA修飾特色
云序生物作為國內最早做m6A的科研平臺，至今用戶已發(fā)表10+篇m6A相關文章，其中多篇影響因子超過10分，成為國內m6A測序最專業(yè)的服務平臺。云序生物RNA修飾高通量測序產品覆蓋面廣，包括編碼mRNA和非編碼lncRNA，circRNA，microRNA等分子。云序生物既提供針對單個分子的m6A測序，也提供一次檢測多種RNA分子m6A修飾的全轉錄組測序，此外公司長期致力于提供優(yōu)質前沿表觀研究測序產品，結合最新科研熱點繼m6A、m5C、m1A之后，隆重推出多款RNA新修飾，不僅有m7G測序，還包括m3C測序、ac4C乙�；瘻y序和2'-O-甲基化測序，打造了全修飾和全分子覆蓋的研究平臺。
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云序生物國內獨家提供RNA修飾測序一站式服務
云序生物提供比色法檢測整體m6A修飾水平、RNA修飾測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down機制等研究服務。2016年至今，檢測樣本數量累積超過5000+，MeRIP富集成功率高達98%以上。為解決客戶樣本量少的問題，云序早已經推出超微量MeRIP測序技術，500ng總RNA即可完成測序。特殊樣本如血清，血漿，外泌體和石蠟等也可進行RNA修飾測序。
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