幾種基因敲除細胞株構建方法的介紹與比較

眾所周知，CRISPR-Cas9作為一項基因編輯技術，目前已經(jīng)是生命科學領域家喻戶曉的技術了。但雖說這項技術非�；鸨�，仍有許多同學對基因編輯技術存在理解偏差，比如最常見的，在應用CRISPR-Cas9構建基因敲除（KO）細胞系，到底采用質(zhì)粒法、病毒法還是有其他更好的方法呢？

說到這個問題，就不得不提當初CRISPR-Cas9技術剛興起時，所展現(xiàn)的切割效率和敲除成功率極大的吸引了科研界的關注，但是科研人員進行相關實驗時經(jīng)常會遇到：“一學就會，一做就廢”的問題。他們發(fā)現(xiàn)，完全按照文獻的方法進行基因敲除，成功率并沒有想象的高，且還存在對細胞轉(zhuǎn)染效率低的問題。因此有一些課題組就嘗試通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式進行敲除，提高轉(zhuǎn)染效率的同時，將Cas9蛋白基因整合到基因組中，通過提高增加Cas9蛋白和sgRNA的作用時間來提高細胞敲除效率。
 

★ 慢病毒法 ★

但是，慢病毒感染存在著兩個比較關鍵的問題：
1. 利用慢病毒法轉(zhuǎn)染Cas9會在敲除靶基因的同時引入新的基因，而且慢病毒轉(zhuǎn)染的外源基因是隨機整合，存在影響其他基因表達的風險。

2. CRISPR-Cas9編輯過程存在脫靶效應，慢病毒法會持續(xù)表達Cas9蛋白，長期存在的Cas9蛋白會對這種脫靶效應有累積效應，最終影響實驗的嚴謹性。
 

圖1. 慢病毒感染進行基因敲除

★ 質(zhì)粒法 ★

為了降低這種脫靶效應，采用的策略是減少Cas9蛋白與sgRNA復合物在細胞中的存留時間，因此我們還可以采用質(zhì)粒法進行KO細胞的構建。即通過將Cas9和sgRNA表達載體瞬時轉(zhuǎn)染到目的細胞中，從而在細胞內(nèi)表達Cas9蛋白和gRNA，由于質(zhì)粒整合到基因組的概率極低，隨著細胞傳代質(zhì)粒載體的逐漸消失，再經(jīng)過PCR驗證和測序篩選出純合的敲除細胞。但質(zhì)粒法也存在一個較大的問題，即感染效率較低。

★ RNP法 ★

與質(zhì)粒法不同的是，RNP法是通過電刺激轉(zhuǎn)染的方法直接將Cas9蛋白和sgRNA復合物轉(zhuǎn)染到細胞中。由于Cas9蛋白是不帶電荷的，而sgRNA是帶電荷的，因此只有當Cas9與sgRNA結(jié)合后，才能更高效的將兩者轉(zhuǎn)染到細胞中。同時，由于Cas9和sgRNA會被降解，Cas9-sgRNA復合物在細胞內(nèi)的存留時間不會很長，因此發(fā)生脫靶的概率很低，但相應的切割效率也可能有一定降低。

圖2. Cas9蛋白與gRNA形成RNP復合物

從國內(nèi)外文獻報道的情況來看，質(zhì)粒法和RNP法是目前主流的基因敲除策略，對于課題組實驗室而言，質(zhì)粒法可能更容易實施，而對于生物技術企業(yè)，RNP法則具有更高的實驗效率。但這兩種不同的方法只是殊途同歸，只要能達到敲除效果的就是好方法。
 

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