RRBS等揭示DNA甲基化-腫瘤免疫逃逸-腎上腺皮質癌侵襲的相關性

腎上腺皮質癌（Adrenocortical carcinoma，ACC）是一種罕見的侵襲性腎上腺內分泌癌。在腎上腺皮質癌中，最近研究表明以CpG島甲基化表型(CpG island methylator phenotype，CIMP)為特征的亞型與特別差的預后相關。然而CIMP的驅動因素仍然未知。此外，CIMP與腎上腺皮質癌患者臨床預后不良之間的功能關系尚不明確。
 
2023年8月2日，法國巴黎大學Valentina Boeva團隊在《Clinical Epigenetics》雜志發(fā)表題為“DNA hypermethylation driven by DNMT1 and DNMT3A favors tumor immune escape contributing to the aggressiveness of adrenocortical carcinoma”的研究論文，該研究通過RRBS、RNA-seq等組學研究揭示了由DNMT1和DNMT3A驅動的DNA高甲基化有利于腫瘤免疫逃逸，從而導致腎上腺皮質癌侵襲。
標題：DNA hypermethylation driven by DNMT1 and DNMT3A favors tumor immune escape contributing to the aggressiveness of adrenocortical carcinoma（由DNMT1和DNMT3A驅動的DNA高甲基化有利于腫瘤免疫逃逸，從而導致腎上腺皮質癌的侵襲性）
時間：2023-08-02
期刊：Clinical Epigenetics（臨床表觀遺傳學）
影響因子：IF 5.7 / 1區(qū)
技術平臺： RNA-seq、RRBS等
 
研究摘要：
本研究通過RRBS、RNA-seq等分析結果表明腎上腺皮質癌（ACC）中的CIMP與DNA甲基轉移酶DNMT1和DNMT3A高表達有關，而這主要由基因拷貝數(shù)的增加和細胞過度增殖驅動。此外，本研究驗證了CIMP通過促進腫瘤免疫逃逸以促進腫瘤的侵襲性，而通過用去甲基化劑5-氮雜胞苷（5-azacytidine）處理可以至少部分逆轉這種效應。
本研究結果表明，與去甲基化藥物聯(lián)合治療可能會提高免疫治療的療效，并可能為高CIMP腎上腺皮質癌患者提供一種新的治療方法。


研究結果：
（1）ACC中的CIMP與DNMT1和DNMT3A高表達相關
圖1：DNMT1和DNMT3A的表達水平在hCIMP-ACC中上調，并與拷貝數(shù)增加相關。

1. DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、TET1、TET2和TET3在TCGA數(shù)據(jù)集患者中l(wèi)CIMP (n = 32)、iCIMP (n = 26)、hCIMP (n = 21)的表達水平（雙側t檢驗，***p<0.005）。
2. 根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)集的DNMT1或DNMT3A表達（分為高、中、低），利用Kaplan–Meier分析ACC患者的總生存率。
3. 在含有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因的染色體中hCIMP-ACC和lCIMP-ACC的拷貝數(shù)變化模式。
4. TCGA患者DNMT1和DNMT3A基因拷貝數(shù)狀態(tài)的表達水平。

 
（2）拷貝數(shù)異常和增殖增加共同導致了ACC中DNMT高表達
圖2：hCIMP-ACC腫瘤中細胞增殖增加可能是DNMT1和DNMT3A表達上調以及DNMT基因拷貝數(shù)畸變的第二驅動因素。
a-b.  DNMT1（a）或DNMT3A（b）表達與細胞增殖之間的相關性；hCIMP樣本（n=21，橙色），iCIMP（n=26，黃色）和lCIMP（n = 32，藍色）。
c.    使用TCGA數(shù)據(jù)集的偏相關分析對DNMT基因的基因組拷貝數(shù)狀態(tài)、細胞增殖和基因表達之間的相互依賴性進行建模。Rpartial表示在調控第三因素時計算的Pearson偏相關系數(shù)。
d-e.  分別用1µM或5µM的增殖抑制劑AZD-5438（AZD）處理hCIMP-ACC和lCIMP-ACC細胞系H295R（d）和MUC-1（e）48h后，分析對DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和增殖標記物MKI67表達的影響。使用DMSO作為載體。數(shù)據(jù)表示4個生物重復的平均值±SEM（Wilcoxon檢驗，*p<0.05，**p<0.01）。
 
（3）高CIMP和低CIMP腫瘤在增殖和免疫反應基因表達特征方面存在差異
表1：hCIMP和lCIMP樣本的基因集富集分析(GSEA)結果比較
 圖3：hCIMP-ACC腫瘤的特征是腫瘤浸潤免疫細胞豐度較低。

1. 對TCGA數(shù)據(jù)集中hCIMP腫瘤中DNA甲基化抑制基因的通路富集分析。使用完整的KEGG通路數(shù)據(jù)集分析，圖中只描述顯著富集的通路。
2. 在TCGA數(shù)據(jù)集的lCIMP (n=32)， iCIMP (n=26)和hCIMP (n = 21)樣本中，使用mcp計數(shù)器計算腫瘤浸潤的免疫和非免疫基質細胞群的相對豐度。使用Kruskal-Wallis檢驗比較每個種群的相對豐度，然后使用Benjamini-Hochberg校正的Dunn檢驗。***p < 0.001。
3. 左：腫瘤浸潤CD3+ T細胞百分比的定量。數(shù)據(jù)來自至少6個生物重復的平均值±SEM。Mann-Whitney U檢驗p=0.12。右：高浸潤lCIMP樣本和低浸潤hCIMP樣本的代表性截圖

 
（4）用DNA去甲基化劑處理hCIMP-ACC細胞系可重新激活與免疫系統(tǒng)相關的基因
圖4：去甲基化藥物5-氮雜胞苷(5-azacytidine, AZA)可以部分恢復hCIMP-ACC細胞系H295R中CpG島的DNA高甲基化，恢復免疫應答基因活性。

1. AZA處理后，H295R(5242個基因)、MUC-1(125個基因)和HUVEC(254個基因)細胞系中，存在顯著上調或下調的基因重疊(FDR < 0.05)。
2. 經(jīng)5 μM AZA處理或未處理的3種細胞系(H295R, MUC-1和HUVEC)的啟動子CpG島甲基化情況，進行無監(jiān)督分層聚類。使用甲基化水平變化最大的CpG (s.d. > 0.4)進行聚類分析。
3. 在RRBS reads覆蓋的CpG中甲基化CpG的整體百分比。AZA誘導三種細胞系CpG甲基化水平降低，但這種作用在DNA甲基化基礎水平最低的MUC-1細胞系中不太明顯。
4. AZA誘導H295R基因啟動子去甲基化的通路富集分析。與免疫應答相關的通路用紅色突出顯示。
5. 位于兩個免疫應答基因啟動子H295R的差異甲基化區(qū)域(DMRs)示例。

 
研究小結：
本研究結果闡明DNMT1和DNMT3A高表達是基因拷貝數(shù)增加和細胞過度增殖的結果，構建了ACC中CIMP原因和結果的表型機制研究。此外，研究揭示了CIMP通過促進腫瘤免疫逃逸對腫瘤的侵襲性產(chǎn)生直接影響(圖5)。且通過去甲基化劑AZA處理，這一作用可以至少部分逆轉。總之，本研究結果強烈表明，DNA去甲基化藥物和免疫治療藥物聯(lián)合治療hCIMP-ACC患者可能對患者生存產(chǎn)生積極影響。

圖5：本研究提出了ACC高CIMP（hCIMP）的建立模型。DNA甲基轉移酶DNMT1和DNMT3A在基因組畸變和過度增殖的驅動下表達增加，導致數(shù)百個基因啟動子區(qū)DNA甲基化增加；因此，免疫應答相關基因的甲基化依賴性沉默導致免疫細胞對腫瘤浸潤減少。
 
參考文獻：
Kerdivel G, Amrouche F, Calmejane MA, Carallis F, Hamroune J, Hantel C, Bertherat J, Assié G, Boeva V. DNA hypermethylation driven by DNMT1 and DNMT3A favors tumor immune escape contributing to the aggressiveness of adrenocortical carcinoma. Clin Epigenetics. 2023 Aug 2;15(1):121.