小鼠模型在揭示免疫檢查點(diǎn)LAG3新機(jī)制中的應(yīng)用，為精準(zhǔn)治療提供新策略

3月17日，上海科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院王皞鵬課題組聯(lián)合中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心許琛琦課題組、美國(guó)匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院Dario Vignali課題組、北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院孔燕課題組及百濟(jì)神州沈志榮團(tuán)隊(duì)，在國(guó)際頂尖學(xué)術(shù)期刊Cell雜志在線發(fā)表了題為“Ligand-Induced Ubiquitination Unleashes LAG3 Immune Checkpoint Function by Hindering Membrane Sequestration of Signaling Motifs”的最新研究論文。該研究首次解析了免疫檢查點(diǎn)LAG3受體激活的分子開關(guān)機(jī)制，并開發(fā)了基于功能性生物標(biāo)志物的療效預(yù)測(cè)體系，為靶向免疫檢查點(diǎn)的精準(zhǔn)治療提供了新策略。

南模生物為該研究提供了LAG3-KO（目錄號(hào)：NM-KO-18048）和LAG3^K490R小鼠。

LAG3作為一種免疫檢查點(diǎn)受體，在調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化和抗腫瘤免疫方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。據(jù)報(bào)道，多個(gè)配體與LAG3相互作用，包括MHC II類和FGL1，前者在抗原呈遞細(xì)胞上表達(dá)，后者分別由肝細(xì)胞和某些類型的腫瘤細(xì)胞分泌。當(dāng)與配體結(jié)合時(shí)，LAG3會(huì)抑制T細(xì)胞活化、細(xì)胞因子生成和增殖，從而促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。

1 在T細(xì)胞激活過(guò)程中，MHC II類介導(dǎo)的配體結(jié)合會(huì)引發(fā)LAG3快速泛素化
作者利用T細(xì)胞-APC共培養(yǎng)系統(tǒng)，將人LAG3異位表達(dá)于Jurkat T細(xì)胞，與表達(dá)MHC II的Raji B細(xì)胞共培養(yǎng)并激活TCR。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，激活的T細(xì)胞中 LAG3的498位點(diǎn)賴氨酸發(fā)生泛素化，而靜止T細(xì)胞中未檢測(cè)到。進(jìn)一步研究表明，與MHC II結(jié)合缺陷的突變體LAG3^P115A不能發(fā)生泛素化，阻斷LAG3與MHC II結(jié)合的relatlimab也能完全抑制LAG3泛素化，以上結(jié)果證明LAG3泛素化依賴于配體結(jié)合。此外，作者利用LAG3^K490R小鼠（由南模生物提供）（LAG3的490位賴氨酸突變?yōu)榫�氨酸，相�?dāng)于人類的K498位點(diǎn)）證實(shí)了在小鼠CD4和CD8初級(jí)T細(xì)胞中，抗原刺激同樣會(huì)使LAG3 大量泛素化，且 K490是關(guān)鍵的泛素化位點(diǎn)。

以上結(jié)果表明，在T細(xì)胞活化過(guò)程中，MHC II類結(jié)合會(huì)觸發(fā)位于LAG3胞質(zhì)尾中部的保守賴氨酸殘基快速泛素化。

Fig1. 配體結(jié)合誘導(dǎo)LAG3的快速泛素化。

Fig2. 膜結(jié)合型而非可溶性FGL1觸發(fā)LAG3的泛素化。

3 LAG3泛素化不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解，反而會(huì)增強(qiáng)LAG3的功能
為探究泛素化修飾對(duì)LAG3蛋白穩(wěn)定性的影響，作者比較了野生型（LAG3^WT）與泛素化位點(diǎn)突變型（LAG3^KR）小鼠T細(xì)胞在活化過(guò)程中LAG3的表達(dá)動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明，LAG3^WT與LAG3^KR的LAG3蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異。進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮（CHX）阻斷新蛋白合成后，無(wú)論處于靜息狀態(tài)或活化狀態(tài)，LAG3^WT與LAG3^KR蛋白的半衰期均相似。以上結(jié)果表明，LAG3的泛素化修飾并不參與其蛋白降解調(diào)控。

鑒于不同類型多聚泛素化介導(dǎo)的生物學(xué)功能具有差異，作者首先確定了LAG3特異性泛素化鏈類型。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)主要存在K48、K63及非經(jīng)典K11連接型泛素鏈。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)LAG3活化后主要發(fā)生非K48連接型、非降解性多聚泛素化（與蛋白酶體降解相關(guān)的泛素化為K48）。

同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)Relatlimab（阻斷LAG3介導(dǎo)的T細(xì)胞活化負(fù)調(diào)控）可完全抑制LAG3泛素化，提示泛素化可能調(diào)控其抑制功能，且在Jurkat T細(xì)胞-Raji細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，Relatlimab可逆轉(zhuǎn)LAG3對(duì)IL-2分泌的抑制作用。此外，LAG3^KR突變體（無(wú)法發(fā)生泛素化）幾乎失去抑制活性。綜上，泛素化通過(guò)非降解途徑正向調(diào)控LAG3的免疫抑制功能。
 

Fig3.  泛素化以不依賴于蛋白質(zhì)降解的方式調(diào)控LAG3功能。

4 Cbl家族E3泛素連接酶介導(dǎo)LAG3的泛素化
為了探究參與LAG3泛素化的E3連接酶，研究人員采用TurboID標(biāo)記技術(shù)，發(fā)現(xiàn)c-Cbl和Cbl-b可能是介導(dǎo)LAG3泛素化的關(guān)鍵E3連接酶。作者進(jìn)一步構(gòu)建了c-CbI和CbI-b單敲除及雙敲除的Jurkat T細(xì)胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)敲除c-Cbl或Cbl-b均無(wú)法阻斷LAG3泛素化，LAG3功能仍保留；而雙敲除細(xì)胞中LAG3泛素化完全消失，喪失抑制活性；進(jìn)一步在雙敲除Jurkat細(xì)胞中回補(bǔ)c-Cbl或Cbl-b，可顯著恢復(fù)LAG3泛素化及其功能。這些結(jié)果表明，Cbl家族連接酶通過(guò)介導(dǎo)LAG3泛素化正向調(diào)控其免疫抑制功能。
 

Fig4. Cbl-b和c-Cbl介導(dǎo)LAG3的泛素化及其抑制功能。

5 LAG3 泛素化通過(guò)阻礙膜結(jié)合釋放抑制信號(hào)
為進(jìn)一步明確泛素化調(diào)控LAG3功能的分子機(jī)制。作者首先對(duì)LAG3進(jìn)行了序列分析，結(jié)果顯示，LAG3的近膜段存在一個(gè)進(jìn)化保守的堿性殘基富集序列（BRS）基序。作者推測(cè)LAG3的BRS基序可能通過(guò)膜結(jié)合限制FSALE基序的可及性。為驗(yàn)證這一推測(cè)，作者使用多種生物物理測(cè)定方法，證實(shí)了LAG3-NCR和LAG3-FL能與模擬細(xì)胞膜的PMLC結(jié)合，且 FSALE 基序插入到膜雙層的疏水內(nèi)部。而LAG3泛素化可有效破壞這種相互作用，使FSALE基序暴露，從而激活LAG3信號(hào)傳導(dǎo)。
 

Fig5. LAG3信號(hào)尾部嵌入細(xì)胞膜，經(jīng)Ub修飾后釋放。

6 LAG3 泛素化通過(guò)阻礙膜結(jié)合釋放抑制信號(hào)
為探究LAG3泛素化在體內(nèi)抗腫瘤免疫中的作用，作者通過(guò)檢測(cè) LAG3^KR小鼠（LAG3泛素化缺陷）的T細(xì)胞功能，發(fā)現(xiàn)其在體外對(duì)T細(xì)胞激活和功能的抑制作用受損，產(chǎn)生的細(xì)胞因子增多，T細(xì)胞增殖抑制能力下降。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，作者在LAG3^WT、LAG3^KR及LAG3^KO小鼠皮下接種MC38結(jié)腸癌，聯(lián)合PD-1阻斷治療。結(jié)果顯示，相較于LAG3^WT小鼠，LAG3^KR小鼠腫瘤進(jìn)展顯著減緩，生存率顯著提高，產(chǎn)生干擾素γ（IFN-γ）的T細(xì)胞比例顯著增多，這一結(jié)果與LAG3^KO相似。以上結(jié)果表明，LAG3泛素化在體內(nèi)對(duì)LAG3介導(dǎo)的抗腫瘤免疫抑制起著關(guān)鍵作用。
 

Fig6. LAG3泛素化在LAG3介導(dǎo)的抗腫瘤免疫抑制中的關(guān)鍵作用。

Fig7. LAG3泛素化作為癌癥免疫治療中的潛在生物標(biāo)志物。

總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究揭示了LAG3與配體結(jié)合后的蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM），發(fā)現(xiàn)配體誘導(dǎo)的泛素化不僅可作為 LAG3信號(hào)傳導(dǎo)的指標(biāo)，還充當(dāng)LAG3功能的分子開關(guān)。在沒(méi)有配體的情況下，LAG3主要通過(guò)暴露的EP基序發(fā)揮其抑制作用，而FSALE基序則與細(xì)胞膜結(jié)合而被隔離。在與配體結(jié)合后，LAG3在E3泛素化連接酶Cbl介導(dǎo)的 KIEELE 基序內(nèi)迅速發(fā)生泛素化，使FSALE從細(xì)胞膜上釋放，從而實(shí)現(xiàn)LAG3的功能。

這項(xiàng)研究揭示了一種具有轉(zhuǎn)化潛力的癌癥免疫治療中的免疫檢查點(diǎn)觸發(fā)機(jī)制，并開發(fā)了可預(yù)測(cè)LAG3治療效果的新型生物標(biāo)志物，為腫瘤免疫的精準(zhǔn)治療提供了新策略。

南模生物擁有經(jīng)驗(yàn)豐富的模型定制團(tuán)隊(duì)，可為客戶定制敲除、條件性敲除、點(diǎn)突變、人源化、敲入等多種類型的基因編輯小鼠。此外，南模生物擁有含上萬(wàn)種成品小鼠的模型資源庫(kù)，基本覆蓋熱門基因的敲除/條件性敲除小鼠、免疫缺陷小鼠、靶點(diǎn)人源化小鼠、自發(fā)疾病小鼠、Cre/Dre 工具鼠、熒光示蹤小鼠等。

若您有相關(guān)需求，歡迎撥打400-728-0660熱線，或通過(guò)南模生物微信公眾號(hào)在線咨詢。我們的專業(yè)團(tuán)隊(duì)將竭誠(chéng)為您服務(wù)！

關(guān)于我們
上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，簡(jiǎn)稱"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科創(chuàng)板上市高科技生物公司（股票代碼：688265），始終以編輯基因、解碼生命為己任，專注于模式生物領(lǐng)域，打造了以基因修飾動(dòng)物模型研發(fā)為核心，涵蓋多物種模型構(gòu)建、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥物臨床前評(píng)價(jià)等多個(gè)技術(shù)平臺(tái)，致力于為全球高校、科研院所、制藥企業(yè)等客戶提供全方位、一體化的基因修飾動(dòng)物模型產(chǎn)品解決方案。