利用 CRISPR/Cas9 技術構建基因敲除小鼠的實驗流程

在現(xiàn)代生物學研究中，CRISPR/Cas9 技術為構建基因敲除小鼠提供了高效精準的手段。以下是運用該技術構建基因敲除小鼠的詳細實驗流程：

實驗設計

1、目標基因的選擇與 sgRNA 設計

• 靶基因分析：首先要確定目標基因，著重挑選其外顯子區(qū)域，一般優(yōu)先選取早期外顯子，這樣能有效提高基因敲除的成功率。
• sgRNA 設計：借助專業(yè)的在線工具，像 CRISPR Design、Benchling、CRISPOR 等來精心設計靶向目標序列的 sgRNA。設計時要嚴格把關，篩選出高特異性的 sgRNA，盡可能避免脫靶現(xiàn)象，其長度通常固定為 20bp。與此同時，Cas9 的選擇也不容忽視，一般常用來源于化膿鏈球菌的 SpCas9，并且要保證它與所選的 sgRNA 能夠完美兼容。另外，如果實驗需要引入特定突變或者大片段缺失，那就得著手設計同源重組修復模板（HDR 模板）。

2、實驗動物選擇

• 小鼠品系：實驗常選用 C57BL/6 或者 FVB/N 等品系的受精卵，而且要選取處于原核期的胚胎。這些品系的小鼠在遺傳學研究領域應用廣泛，能為實驗提供穩(wěn)定可靠的基礎。
• 動物倫理：整個實驗必須通過倫理委員會的嚴格審批，確保實驗過程遵循動物福利原則，不對實驗動物造成不必要的傷害。

實驗材料制備

1、體外轉錄或合成 CRISPR 組件

• sgRNA 合成：可以通過化學合成的方式，也可以采用體外轉錄法。若選擇體外轉錄，務必添加 T7 啟動子以及 sgRNA 骨架，以此保障 sgRNA 的正常合成與后續(xù)功能發(fā)揮。
• Cas9 mRNA 制備：同樣采用體外轉錄的方法來制備 Cas9 mRNA，過程中要添加 5' 帽結構以及 polyA 尾，這對提高 Cas9 mRNA 的穩(wěn)定性至關重要，能確保它在后續(xù)實驗環(huán)節(jié)中穩(wěn)定發(fā)揮作用。
• 純化：完成 sgRNA 和 Cas9 mRNA 的制備后，要對它們進行精細純化，去除可能存在的雜質。因為雜質一旦混入，極有可能影響后續(xù)胚胎的存活率，干擾實驗進程。

2、顯微注射混合液配制

將 sgRNA 按照 50 - 100ng/μL 的濃度、Cas9 mRNA 以 100 - 200ng/μL 的濃度，一同混合于顯微注射緩沖液中，常用的是 RNase - free TE 緩沖液。倘若實驗用到了 HDR 模板，還需依據(jù)具體實驗需求，準確加入線性化質�；� ssDNA，并合理調整其濃度。

受精卵的獲取與顯微注射

1、超排卵與受精卵采集

• 超排卵：對雌性小鼠注射孕馬血清促性腺激素（PMSG），間隔 48 小時后，再注射人絨毛膜促性腺激素（hCG），以此刺激雌鼠超排卵，為后續(xù)獲取充足的受精卵創(chuàng)造條件。
• 交配：將完成超排卵處理的雌鼠與雄鼠合籠，之后仔細檢查雌鼠陰栓情況，以此確認受精卵是否處于原核期，正常情況下受精后約 0.5 天受精卵會處于該關鍵時期。
• 受精卵收集：確認受精卵狀態(tài)后，處死雌鼠，小心沖洗其輸卵管，從中精準收集處于原核期的受精卵，這些受精卵將作為后續(xù)實驗的核心材料。

2、顯微注射

• 顯微操作：運用專業(yè)的顯微注射儀，將預先配制好的 CRISPR 混合液（包含 sgRNA、Cas9 mRNA，如有需要還包括 HDR 模板）精準注入受精卵的原核或者細胞質內。這一步操作對技術要求極高，需要操作人員具備精湛的顯微操作技能。
• 胚胎培養(yǎng)：完成顯微注射后的胚胎，要在適宜的體外環(huán)境中培養(yǎng)，直至發(fā)育到兩細胞期或者囊胚期，這個過程大約需要 24 小時。在此期間，要嚴格把控培養(yǎng)條件，確保胚胎能夠正常生長發(fā)育。

胚胎移植與代孕母鼠

1、代孕母鼠準備

通過讓結扎雄鼠與雌鼠交配，誘導雌鼠產生假孕狀態(tài)，這些代孕母鼠將作為胚胎移植的受體，為后續(xù)植入胚胎提供孕育環(huán)境。

2、胚胎移植

依據(jù)胚胎發(fā)育所處的階段，將培養(yǎng)好的胚胎準確移植到代孕母鼠相應的部位，若是兩細胞期胚胎，一般移植到輸卵管；若已發(fā)育至囊胚期，則移植到子宮。為提高妊娠成功率，通常每只母鼠會移植 10 - 15 枚胚胎。

子代小鼠鑒定

1、F0 代小鼠基因型分析

樣本采集：待子代小鼠出生大約 3 周后，小心剪取其尾巴，以此提取基因組 DNA，作為后續(xù)基因型分析的樣本。

PCR 擴增靶區(qū)域：專門設計能夠擴增 sgRNA 靶點附近區(qū)域的引物，利用 PCR 技術對樣本 DNA 進行擴增，獲取足量的靶區(qū)域 DNA 片段用于后續(xù)檢測。

檢測方法：

• TA 克隆測序：將 PCR 產物進行克隆處理，之后測序分析，通過這種方式能夠精準檢測出插入 / 缺失（Indel）突變情況，為判斷基因敲除效果提供直接依據(jù)。
• T7E1 或 Surveyor 酶切：這種方法主要用于快速篩查，通過檢測雙鏈 DNA 錯配情況，初步判斷基因是否發(fā)生突變，能在短時間內處理大量樣本，提高篩選效率。
• 高通量測序（NGS）：該技術能夠精確解析突變類型，同時還能深入分析是否存在脫靶效應，為實驗結果的準確性和可靠性保駕護航。

2、嵌合體篩選

F0 代小鼠有很大概率是嵌合體，即其身體部分細胞攜帶突變基因。為獲得穩(wěn)定遺傳的純合子，需要將 F0 代小鼠與野生型小鼠進行配種，繁育出 F1 代，再從 F1 代中篩選出純合子個體。

表型分析與品系建立

1、表型分析

生理功能檢測：密切觀察子代小鼠在生長發(fā)育過程中的各項生理指標，包括生長速度、行為模式、代謝水平等方面是否出現(xiàn)異常，以此推斷基因敲除對小鼠整體生理功能的影響。

分子水平驗證：運用 Western blot、qPCR 等分子生物學技術，檢測目標蛋白或者 mRNA 在小鼠體內的表達情況，確定是否因基因敲除而出現(xiàn)表達缺失，從分子層面揭示基因功能變化。

組織學分析：制作小鼠組織病理切片，在顯微鏡下細致觀察不同組織器官的結構和細胞形態(tài)變化，探尋是否存在組織特異性的表型改變，進一步剖析基因敲除引發(fā)的深層次生物學效應。

2、品系純化

通過連續(xù)回交或者兄妹交配的方式，在 F1 代、F2 代中逐步篩選并培育出純合子個體，建立起穩(wěn)定遺傳的基因敲除小鼠品系，為后續(xù)深入研究提供可靠的動物模型。

注意事項

脫靶效應：在實驗前期，要充分利用生物信息學工具預測可能出現(xiàn)的脫靶位點，對于關鍵實驗，如有必要還需進行全基因組測序驗證，確保實驗結果的精準性，避免因脫靶效應導致錯誤結論。

胚胎存活率：由于顯微注射操作具有一定的侵入性，很可能對胚胎造成損傷，進而影響其存活率。所以在實驗過程中，要反復優(yōu)化注射條件，包括注射物質的濃度、注射體積等參數(shù)，盡可能降低對胚胎的傷害，保障實驗順利推進。

基因型 - 表型關聯(lián)：鑒于 F0 代嵌合體小鼠表型可能不明顯，不能僅憑 F0 代表型判斷基因功能，需要通過繁育獲得 F1 代，對 F1 代進行全面系統(tǒng)的表型分析，以此建立準確的基因型 - 表型關聯(lián)，揭示基因的真實功能。