病理學(xué)服務(wù)：原位末端凋亡法（Tunel）實驗技術(shù)服務(wù)

實驗技術(shù)簡介：TUNEL 技術(shù), 即脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶( Term inal2deoxynucleo t idyl t ran sferase, TdT )介導(dǎo)的x2dU TP 缺口末端標(biāo)記(TdT 2m ediatedx2dU TP n ick end labeling, TUN EL ) 技術(shù)是目前原位檢測細(xì)胞凋亡最敏感、快速、特異的新方法, 已廣泛用于生物、醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)是一種用來檢測細(xì)胞凋亡(apoptosis)的分析方法.細(xì)胞凋亡有一項重要的特征為細(xì)胞內(nèi)的DNA會碎裂成片段(DNA fragmentation),TUNEL可以有效的去探測DNA片段的產(chǎn)生,所以可以傳達(dá)細(xì)胞凋亡的訊息.TdT為terminal deoxynucleotidyl transferase,此種酵素可以在沒有DNA模板的情形下,連結(jié)核甘酸到DNA的3'-OH處.1992年,以色列科學(xué)家Gavrieli等人將TdT引為為標(biāo)定DNA片段的一個酵素,自此衍生出TUNEL此項技術(shù).TUNEL的好處是可以在細(xì)胞凋亡發(fā)生的早期,即可偵測到DNA片段的產(chǎn)生,并且可以直接使用在組織切片上,觀察細(xì)胞凋亡發(fā)生的位置.所以TUNEL目前為廣泛接受與使用的一種細(xì)胞凋亡的分析方法.

實驗操作流程：
1．石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水; 石蠟切片4um貼在涂有切片粘合劑的載玻片上，58。C烤24h，常規(guī)脫蠟至水，二甲苯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 各10分鐘，無水乙醇，95%，85%，75%乙醇，各2分鐘，水洗2分鐘。
2．0.3%H2O2作用  30min,室溫，PBS洗3min×3次；
3．Proteinase K 20ug/ml  37℃ 20min
4．PBS洗3min×3次；
5．0.1%Triton×100 PBS洗3min×3次；
6．PBS洗3min×3次；
7．TUNEL混合液---1ml Tunel緩沖液中加入10ul  b-11-DUTP, 10ul  TDT, 37C  1h,室溫1h
8．PBS洗3min×3次；
9．Streptavidin-HRP  1:400  37C  30min
10．PBS洗3min×3次；
11．0.04%DAB+0.03%H2O2顯色10min，流水洗
12．蘇木精襯染1min，鹽酸乙醇分化，水洗
13．常規(guī)樹脂封片

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